細菌降解增塑劑鄰苯二甲酸酯的研究進展

趙真真，鄭秋英

（1.濰坊學院 種子與設施農業工程學院，山東 濰坊 261061；2.濰坊市環科院環境檢測有限公司，山東 濰坊 261000）

1 引言

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是鄰苯二甲酸酐與醇類在酸性條件下酯化而成的一類重要有機化合物，由一個苯環和兩個相鄰的烷基側鏈構成，根據烷基側鏈的不同可形成多種結構[1]。PAEs 包含30 多種化合物，多為無色、無味、油狀粘稠液體，不易揮發，難溶于水，易溶于甲醇、丙酮、苯等有機溶劑，沸點在190～530℃之間，熔點基本小于-25℃。這類化合物的低熔點和高沸點特性使它們能用作增塑劑、傳熱液和梳理劑被廣泛應用[2]。目前全球PAEs 的年產量約3 億噸，預計到2050 年將達到5 億噸。中國已成為世界上最大的增塑劑生產、消費和進口國，2017 年占世界總消費量的近42%[3]。為了保證基質聚合物的靈活性，PAEs 通常以氫鍵和范德華力結合于塑料制品，因此在生產、應用和處置過程中，PAEs 很容易脫落、擴散滲入環境。目前PAEs 在不同環境中都被廣泛檢測到，給環境和人類健康帶來了巨大的風險[4-5]。PAEs 對哺乳動物的生殖發育、肝臟、心臟和神經系統都有毒害作用，是激素類似物主要作用于生殖系統而引發毒性。目前有關PAEs 對人體毒害性的研究非常有限，但初步研究已表明PAEs 會干擾人體重要的內分泌途徑，PAEs 暴露會導致胎兒生殖器官發育異常和精子活力低下等問題[6]?？傊?，PAEs 對動物和人體健康都構成了極大的威脅，尋求高效、安全的PAEs 降解方法已成為國內外的研究熱點。

2 細菌降解PAEs 的研究

在自然環境中PAEs 的水解和光解等過程非常緩慢，微生物降解是環境中PAEs 消解的主要方式，該過程由一系列酶促反應完成，是一種高效、環保的降解途徑[7]。來自不同生境的微生物已被證明能降解PAEs及其中間產物，包括細菌、真菌和藻類，其中細菌以良好的耐受性和高效的降解效率成為主要研究對象。早在1975 年Engelhardt報道了細菌降解PAEs，之后有學者陸續報道了降解PAEs 菌株的篩選、降解產物和降解途徑等的研究成果[8-10]，研究內容由最初降解菌篩選、降解特性和降解途徑的研究發展到近幾年的PAEs 生物降解酶、降解基因和分子機理的研究，也有部分學者研究了細菌對PAEs 污染的環境修復應用。

2.1 降解菌的篩選研究

目前研究人員從活性污泥、土壤、海洋、河流沉積物和紅樹林濕地等環境中獲取了上百株降解PAEs的細菌，涵蓋芽孢桿菌、節桿菌、紅球菌、戈登氏菌、短桿菌、微桿菌、鞘氨醇單胞菌和假單胞菌等36個屬種[11]。目前研究的活性菌能降解高濃度的PAEs（數百至上千mg/L），例如Sphingomonas yanoikuyaeDOS01 能降解500 mg/L 的DMP[12]。但是環境中PAEs 的濃度一般在納克每升或者微克每升的級別，個別農業設施土壤的PAEs 殘留能達到數十毫克每升，只有污水處理廠的活性污泥中PAEs 能達到幾十或近百毫克每升的水平[1]。較低濃度的PAEs 可能會因為生物利用率過低而不能維持細胞的正常生長，導致PAEs 的難以降解，因此更需要篩選能降解低濃度PAEs 的菌株。目前降解菌的研究多針對某一種PAEs 化合物的降解，而自然環境中同時存在多種PAEs，并且目前的研究以實驗室試驗為主，實際應用研究較少，特別是在極端pH 值、含重金屬和高鹽度等環境條件下的研究更少。因此需要繼續篩選或者人工改造出具有降解譜廣、抗逆性強、環境適應性強的高效菌株，以豐富菌種資源庫。

2.2 細菌對PAEs 的降解途徑

研究PAEs 的生物降解途徑有助于了解其礦化過程及代謝產物的毒理學行為。PAEs 的生物降解可分為兩個階段：第一階段是PAEs 烷基酯鍵水解轉化為關鍵中產物PA；第二階段是PA 的開環裂解、最終降解為小分子物質[13]。

2.2.1 PAEs 酯鍵的水解

PAEs 酯鍵的水解主要有去酯化或脫烷基、β-氧化和反酯化或脫甲基三種方式，以去酯化為主（圖1）。去酯化反應是兩個酯鍵的連續水解，先生成鄰苯二甲酸單酯（MAPs），再生成鄰苯二甲酸。去酯化水解PAEs 途徑同時存在于好氧菌和厭氧菌。β-氧化是側鏈長于DEP 的PAEs 通過去乙基的方式水解、縮短烷基側鏈。反式酯化是DEP 用甲基取代乙基，連續生成鄰苯二甲酸甲乙酯和DMP，再去酯化降解。此外，研究人員還發現Arthrobacter sp.和Aureobacterium saperdaeNRRL B-14840 分別將DMP 和DEP 直接水解為PA，沒有中間產物的產生（圖1 虛線箭頭）[11]。

圖1 PAEs 酯鍵水解的主要途徑

2.2.2 PA 的開環降解

PA 是生物降解PAEs 和多環芳烴等有機物的關鍵中間產物，可進一步羥基化、脫氫和脫羧生成PCA，再經過環裂降解成小分子物質進入TCA 循環（圖2）。好氧菌和厭氧菌降解PA 的方式不同。有氧條件下，G+菌和G-菌轉化PA 為PCA 的方式也不同[14]。在G+菌中，PA 發生苯環3、4 位的羥基化等一系列反應，先被氧化為順式-3，4-二氫-3，4-二羥基鄰苯二甲酸，再脫氫轉化為3，4-二羥基鄰苯二甲酸，再脫羧轉化為PCA。G-菌是發生PA 苯環4、5 位上的羥基化。PCA 在有氧條件下有兩種環裂方式，即鄰位裂解和間位裂解。通過間位環裂解（4，5-開環途徑），PCA 被轉化為4-羧基-2-羥基粘琥珀酸半醛、2-羥基-4-羧基粘琥珀酸半縮醛，最終降解為草酰乙酸和丙酮酸，分別進入TCA 循環和糖酵解途徑。在鄰位環裂（3，4-開環）途徑中，PCA 先降解為3-羧基-順，順-粘康酸和3-己二酸酮酯，再經過β-酮己二酸途徑轉化為琥珀酸和輔酶A，進入TCA 循環。自然環境中PAEs 的生物降解以好氧降解為主，厭氧降解相對緩慢，對厭氧菌降解PAEs 的研究較少。厭氧條件下，PA 通過脫羧反應生成苯甲酸鹽，經過加氫、羥基化、β-氧化轉化為己二酸，最終生成乙酸鹽、CO2和H2。

圖2 生物降解PA 的主要途徑

2.3 PAEs 降解酶

多種蛋白酶參與了PAEs 的細菌降解，包括負責PAEs 轉運的滲透酶，斷裂酯鍵的酯酶或水解酶，PA的環羥基化雙加氧酶，以及環裂解雙加氧酶等，這些酶大多數是誘導酶[15]。目前對催化PA 降解的酶和基因的研究相對透徹，但是PAEs 水解生成PA 的生物降解機理尚未明確，以催化PAEs 去脂化反的酯酶研究為主，對其他酯鍵水解途徑（β-氧化、轉酯化）的研究較少。

目前發現的PAEs 酯酶主要有三類：僅水解PAEs 的酯酶、僅水解MAPs 的酯酶和兩者都水解的酯酶。多數情況下PAEs 的兩個酯鍵由不同的酯酶催化完成，例如從菌株Micrococcus sp.YGJ1 中純化出兩種不同的酯酶，一種是單體蛋白（56 kDa）能轉化PAEs 為MAPs，一種是含亞基（27 kDa）的二聚體蛋白酶（60 kDa），特異性催化水解MAPs 為PA[16]。但是來源于Bacillus sp.K91 的羧酸酯酶（CarEW）能同時降解兩個酯鍵，將PAEs 水解為MAPs 和PA 。據報道，PAEs 的水解酶多含有絲氨酸水解酶家族的保守催化中心，即五肽motif，它含有保守的氨基酸序列GX1SX2G[17-18]。其中，X1是天冬氨酸或組氨酸（天冬氨酸為主），X2通常是疏水殘基（苯丙氨酸、蛋氨酸或亮氨酸），而Gordonia sp.P8219 的MEHP 水解酶的X2是精氨酸[19]，Rhodococcus jostii的PatE 酶是半胱氨酸酯酶[20]。目前，絕大部分PAEs 降解菌的水解酶及其作用機理尚未明確，有待進一步研究。

2.4 PAEs 降解基因

通過細菌的基因組文庫構建和基因組測序注釋等方法發現了多種PAEs 水解酶的基因。基于基因組測序和功能注釋，Hara 等在R.jostiiRHA1 中發現基因patE 編碼的水解酶將PAEs 水解為PA[21]，黃琳從Bacillus velezensisSYBC H47 的66 個酯酶基因中篩選出4 個羧酸酯酶并驗證具有降解PAEs 的活性[22]。Zhao 等通過研究PAEs 降解菌Rhodococcus sp.2G 的全基因組圖譜，發現了337 個酯酶/水解酶基因[23]。目前已報道的PAEs 酯酶降解基因相對較少，并且對其編碼的酶蛋白有待深入研究，而基因組測序和注釋是一種優選方法，可獲得巨大的基因及蛋白酶的信息數據，從中篩選潛在的功能基因。

3 結論和展望

增塑劑PAEs 具有生態毒性并且在環境中廣泛存在，已經成為一種新興的環境有機污染物，這是當今社會塑料制品長期、大量生產使用造成的難以避免的后果。今后相關的研究方向，一方面應該關注如何增強增塑劑PAEs 與塑料結合的緊密性，減緩其擴散進入環境或者尋找可降解的替代產品；另一方面細菌降解途徑作為一種高效、安全、相對廉價的方法已經成為國內外的研究熱點，但是還需要進一步的探索和完善，特別是篩選廣譜、高效菌群，并提高其環境適應性和應用潛能。