SDH、NADH-TR染色在先天性巨結腸中的應用及臨床意義

王凌燕,張麗麗,任會強,白玉坤,張 萌,安會波

先天性巨結腸(hirschsprung’s disease, HD)為小兒外科常見的消化道畸形,發病率為新生兒的1/5 000,是由于腸神經系統胚胎期發育障礙引起的遠端腸管黏膜下及肌層無神經節細胞[1]。目前,其發病機制尚未完全明了。病理診斷方法包括HE染色、酶組織化學染色、免疫組化染色等,但各染色方法均存在不足,研究新的染色方法對HD病理診斷具有重要意義。本實驗應用SDH、NADH-TR染色,同時結合HE和免疫組化S-100、Calretinin染色對HD進行病理診斷,并探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年9月～2022年11月臨床診斷為HD的術中冷凍組織69例及對應手術切除腸管標本69例(其中手術切除腸管標本中38例為新鮮標本,先部分取材用于SDH、NADH-TR染色,再將剩余標本固定;余31例腸管標本術后直接固定)。患兒年齡2個月～4歲,中位年齡6個月,男童54例,女童15例。所有切片均經兩位高年資病理醫師復核。

1.2 試劑與方法(1)收集HD術后新鮮腸管標本38例,分段取材,OCT包埋劑包埋,將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯中,待裝有異戊烷的小燒杯內杯底及周壁出現白色糊狀,將組織冰托放入小燒杯中,約20 s取出,用Cryotome PSE型恒冷切片機(美國Thermo公司)在-20 ℃下3 μm厚切片,黏附于載玻片上,進行SDH、NADH-TR染色,切片置于染色液中37 ℃孵育40 min,蒸餾水沖洗,甘油明膠封固。其中SDH染色液配制方法:0.2 mol/L琥珀酸鈉5 mL+0.2 mol/L磷酸緩沖液5 mL+NBT(氯化硝基四氮唑蘭)10 mg,攪拌至完全溶解;NADH-TR染色液配制方法:Tris-HCl 20 mL(pH 7.4)+NBT(氯化硝基四氮唑蘭)20 mg+NADH CoI還原型16 mg,攪拌至完全溶解。(2)69例冷凍組織和對應手術切除標本經10%中性福爾馬林固定,分段取材,行HE和免疫組化S-100、Calretinin染色,S-100、Calretinin抗體購自北京中杉金橋公司,免疫組化染色采用EnVision法。

1.3 結果判讀S-100、Calretinin陽性定位于細胞質或細胞核,以細胞質或細胞核內出現棕黃色、黃色時為陽性,Calretinin表達于神經節細胞,不表達于無神經節細胞的神經纖維,S-100同時表達于神經節細胞及神經纖維,在神經節細胞中呈“空泡狀”,在神經纖維中均勻著色。當神經纖維束最大徑≥40 μm時定義為粗大神經纖維。SDH、NADH-TR染色在神經節細胞的細胞質內呈顆粒狀藍色,細胞核不著色,神經纖維呈均勻藍色。

1.4 統計學分析所有數據采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HD中HE染色本組術中冷凍組織狹窄段HE染色見粗大神經纖維69例,均未見神經節細胞。術后切除石蠟標本狹窄段見粗大神經纖維69例,其中偶見神經節細胞2例,冷凍與石蠟組織符合率97.10%。冷凍組織擴張段肌間見神經節細胞者65例,4例擴張段未見明確神經節細胞,再次送檢見神經節細胞。術后石蠟組織切除標本擴張段見神經節細胞69例,其中5例偶見粗大神經纖維,冷凍與石蠟組織符合率為92.75%。

2.2 HD中S-100、Calretinin的表達術后切除標本免疫組化染色顯示,S-100在肌間粗大神經纖維中68例呈陽性(68/69,98.55%),在肌間神經節細胞中67例呈“空泡狀”陽性(67/69,97.10%);Calretinin在肌間神經節細胞中表現為細胞質及細胞核不均勻陽性(67/69,97.10%),在部分肌間粗大神經纖維中表現為點灶狀陽性(2/69,2.90%)。

2.3 HD中SDH、NADH-TR染色本組收集術后切除新鮮腸管38例行SDH、NADH-TR染色,SDH染色顯示粗大神經纖維呈均勻淡藍色(37/38,97.37%)(圖1),腸壁肌間(圖2)和黏膜下(圖3)神經叢內間質呈均勻淡藍色,神經叢內神經節細胞胞質呈細顆粒狀深藍色,細胞核不著色(36/38,94.74%)。NADH-TR染色中粗大神經纖維呈均勻藍色(36/38,94.74%)(圖4),腸壁肌間(圖5)和黏膜下(圖6)神經叢內間質呈均勻藍色,神經叢內神經節細胞胞質呈細顆粒狀深藍色,細胞核不著色(37/38,97.37%),且組織NADH-TR染色較SDH深,不同發育階段的神經節細胞胞質著色面積不同。

2.4 HD中各染色之間的相關性分析在粗大神經纖維染色中,S-100、SDH、NADH-TR染色的陽性率分別為98.55%、97.37%、94.74%,各組間差異無統計學意義。在肌間神經節細胞中,S-100、Calretinin、SDH、NADH-TR染色的陽性率分別為97.10%、97.10%、94.74%、97.37%,各組間差異無統計學意義。

3 討論

HD患兒結腸遠段黏膜下及肌間神經叢中的神經節細胞缺如,形成“肥大神經叢”結構。研究認為其與神經嵴干細胞的遷移、發育、存活異常有關[1],也有研究認為,腸道神經節細胞的不足可以通過局部神經嵴細胞的增殖和分化來代償[2]。細胞增殖所需的能量主要由線粒體內有氧呼吸提供。線粒體還參與細胞分化、細胞信號傳遞和細胞凋亡等過程,并擁有調控細胞生長和細胞周期的能力。因此,觀察線粒體酶的表達對研究HD的神經節細胞缺如與能量代謝之間的關系有重要意義。本實驗應用SDH、NADH-TR兩種酶組織化學法進行觀察,其中SDH為線粒體三羧酸循環的關鍵酶,是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[3];可作為三羧酸循環運行強度的檢測指標[4]。NADH定位于線粒體中,為有氧代謝電子傳遞鏈中的酶,作為供氫體,可反應三羧酸循環、細胞色素系統和其他氧化代謝途徑的利用情況[5]。NADH-TR染色使無色的四唑鹽還原為不溶性的藍紫色,在線粒體上沉淀下來,使線粒體染成深藍色,染色的深淺可顯示線粒體內NADH脫氫酶含量的多少[6]。此前上述兩項組織化學染色常用于神經肌肉組織活檢診斷中。有研究表明HD狹窄段SDH活性升高[7];國內外文獻尚未見NADH-TR在HD組織標本中的報道。

由于嬰幼兒腸神經節細胞發育未成熟,缺乏典型的細胞形態,且在合并結腸炎時淋巴單核細胞與神經節細胞不易鑒別,易導致誤診。因此,目前HD術中冷凍病理診斷多采用HE染色聯合乙酰膽堿酯酶(AchE)、甲苯胺藍等酶組織化學染色法進行診斷。HD術后最終診斷需經石蠟包埋切片,采用HE染色與免疫組化染色相結合,抗體包括NSE、S-100、PGP9.5、Calretinin等。然而,各染色方法并非完美,如HE染色可鑒別神經叢內有無神經節細胞,但對于涉及細胞分化和功能改變的觀察有限[8]。研究發現AchE既存在于膽堿能神經元,也存在于非膽堿能神經元,假陽性率較高[9]。甲苯胺藍染色可顯示神經節細胞內尼氏體的數量,并且觀察尼氏體的數量和形態能反應神經節細胞的成熟程度和功能。但其對粗大神經纖維的判斷并無特異性[10]。S-100蛋白在狹窄段神經節細胞缺失區域可見強陽性的增粗神經纖維[11],而在HD擴張段神經節細胞區域可見“空泡狀”表現,本組中68例肌間粗大神經纖維呈強陽性,67例神經節細胞呈“空泡狀”陽性;但當取材深度不夠時,可能見不到S-100陽性的粗大神經纖維導致漏診。本組中8例擴張段冷凍組織中未見粗大神經纖維,但術后切除擴張段腸壁組織中見粗大神經纖維,且1例粗大神經纖維S-100呈陰性。Calretinin在神經節細胞中陽性,而在神經節細胞缺失的神經纖維中陰性[12]。近期有學者提出Calretinin陽性神經纖維可以延伸至無神經節細胞腸段,因此短段型腸無神經節細胞癥直腸黏膜活檢Calretinin染色出現陽性神經纖維時應警惕假陽性[13]。本組有2例Calretinin染色見陽性神經纖維。由此可見,S-100、Calretinin染色也存在一定的假陽性與假陰性。因此,一些病理學家主張HD的術前診斷應在HE染色的同時必須有其他染色方法共同診斷,以保證診斷的準確性,但是應用酶組織化學還是免疫組化尚未統一[14]。

本實驗對臨床及冷凍診斷為HD的新鮮腸管組織,進行SDH、NADH-TR酶組織化學染色,應用異戊烷-液氮快速冷凍法冷凍組織,恒溫冷凍切片進行染色。異戊烷-液氮快速冷凍的優點在于:首先避免了冷凍造成的冰晶、空泡,其次避免了石蠟包埋引起的酶活性失活。此冷凍方法可應用于HD術中冷凍組織中。本實驗發現SDH、NADH-TR染色均能清晰地顯示神經節細胞的細胞質形態和數量,且對比鮮明,能較準確判斷神經叢內神經節細胞的數量和結構,對研究神經節細胞的線粒體酶分布情況提供新思路。同時,可以準確區分粗大神經纖維及不同發育節段的神經節細胞。SDH與NADH-TR染色對于粗大神經纖維及神經節細胞的染色陽性率與S-100、Calretinin相比差異無統計學意義,且染色更清晰,非特異性著色少。

總之,SDH與NADH-TR具有染色方法簡便、快速、試劑配制簡單、實驗條件易于控制等特點,適用于術中快速冷凍切片檢查,為HD的病理診斷提供新的檢測方法。