基于高效液相色譜指紋圖譜及多模式化學計量學分析評價菝葜飲片的質量

陳彥潔，蔣學青，羅鑫，蔣佳麗，王藝潔，謝譚芳，王志萍*（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530200；2.廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室，南寧 530200）

菝葜為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效[1]。現在研究表明，菝葜中主要含有甾體皂苷類、黃酮類、氨基酸類、甾醇類和有機酸類等化合物[2]，具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂[3]等多種藥理作用，臨床上可用于治療腫瘤、慢性盆腔炎、乳腺增生、卵巢囊腫等[4-5]疾病。

中藥組成復雜，用單一的指標難以分析評價其綜合質量，中藥指紋圖譜技術是評價中藥整體性、穩定性的一種有效方法，從整體上體現中藥的化學特征，符合中醫理論中全面性、整體性的特點，已成為控制天然藥物整體質量的有效手段[6]。

多模式化學計量學分析主要包括聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析（OPLSDA）等，能從整體上對藥材進行評價[7]。指紋圖譜技術結合多模式化學計量學分析能反映出中藥材質量與化學組成的真實情況[8]，基于此，本研究收集了18批不同來源的菝葜飲片，建立了菝葜飲片的HPLC指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析及OPLS-DA，綜合評價菝葜飲片的質量，以期為菝葜的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030 Plus型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XSR205DU/A型電子天平（美國Mettler Toledo公司）；KQ-800DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPH-IV20TN型優普超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：MUST-22111711，純度：99.82%）、落新婦苷（批號：MUST-22032404，純度：98.14%）、白藜蘆醇（批號：MUST-21112413，純度：99.82%）、黃杞苷（批號：MUST-22011202，純度：98.10%）、槲皮苷（批號：MUST-20121401，純度：98.87%）（成都麥德生科技有限公司）；色譜純乙腈、甲醇（美國Fisher公司）；色譜純磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；其余試劑均為分析純（成都市科隆化學品有限公司）。本研究收集了包括安徽、江西、貴州、廣西、廣東及湖南等地的18批菝葜飲片，飲片均由廣西中醫藥大學田慧教授鑒定為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，樣品信息詳見表1。

表1 菝葜飲片來源信息Tab 1 Sample information of Smilax china L.

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取菝葜飲片粉末（過2號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲（320 W，40 kHz）45 min，放冷，補足質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇、綠原酸及槲皮苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為 0.420、0.190、0.260、0.666、0.206 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，9%A；25～110 min，9%～29%A；110～115 min，29%～9%A；115～120 min，9%A）；流速：1 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：302 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 精密度試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣分析6次，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.39%，相對峰面積RSD＜2.3%，表明儀器的精密度符合指紋圖譜要求。

2.2.3 重復性試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，平行6份，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜1.6%，相對峰面積RSD＜2.7%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.57%，相對峰面積RSD＜1.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價 取18批菝葜飲片，按“2.1.1”項方法制備，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，導入到中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），將編號為YP1的樣品設為參照圖譜，用中位數法將各批次樣品計算出的數據進行峰匹配生成指紋圖譜共有模式，標定了13個共有峰，結果見圖1。相似度計算公式如下[9-10]，式中xi和yi分別代表兩組樣品的共有峰峰面積。18批菝葜飲片圖譜與對照圖譜相比，除YP3以外，其余相似度均大于0.9（見表2），表明18批不同來源的菝葜飲片一致性較好，可以用于評價菝葜飲片的綜合質量。

圖1 18批菝葜飲片HPLC疊加圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 18 batches of Smilax china L.

表2 18批菝葜飲片的相似度Tab 2 Similarity of 18 batches of Smilax china L.

2.2.6 共有峰指認 通過與已知混合對照品溶液色譜圖比較保留時間，結果見圖2～3，13個共有峰共指認出5個峰，其中峰2為綠原酸，峰5為落新婦苷，峰8為槲皮苷，峰9為黃杞苷，峰10為白藜蘆醇。

圖2 菝葜飲片對照圖譜Fig 2 HPLC specific chromatogram of Smilax china L.

圖3 混合對照品溶液的HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2.2.7 聚類分析 以18批菝葜飲片共有峰峰面積為變量，經Z標準化處理后導入SPSS 25.0軟件，采用系統聚類中組間連接的聚類方法，以平方歐氏距離為區間，進行聚類，共聚為三類，其中YP1～YP3聚類一類，YP7～YP10聚為一類，YP4～6、YP11～18聚為一類，結果見圖4。

圖4 18批菝葜飲片聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 主成分分析 以18批菝葜飲片共有峰峰面積為變量，經Z標準化處理后導入SPSS 25.0軟件，通過降維的手段進行主成分分析，結果Bartlett 球形度檢驗P＜0.01，表明主成分分析模型成立，以特征值＞1提取了3個主成分，方差貢獻率分別是43.428%、24.878%、14.548%，累積方差貢獻率為82.854%，見表3，結合碎石圖（見圖5）分析，3個成分的曲線斜率較大，表明這3個主成分能代表該18批菝葜飲片指紋圖譜的大部分信息，可作為綜合指標對菝葜飲片的質量進行評價。

圖5 碎石圖Fig 5 Gravel diagram

表3 主成分特征值及方差貢獻率Tab 3 Principal component eigen value and variance contribution rate

從表4主成分載荷系數可知，主成分1主要反映峰1、峰2（綠原酸）、峰3、峰5（落新婦苷）、峰6、峰7、峰8（槲皮苷）、峰9（黃杞苷）、峰11和峰13的信息，主成分2主要反映峰1、峰4、峰10（白藜蘆醇）和峰12的信息，主成分3主要反映峰13的信息。

表4 主成分載荷矩陣Tab 4 Principal component load matrix

利用SPSS 25.0軟件對主成分載荷進行分析，以主成分載荷系數除以對應特征值的算數平方根得到線性組合系數，有關線性模型如下：

成分1得分＝0.324×峰1-0.378×峰2-0.385×峰3+0.121×峰4-0.253×峰5+0.290×峰6+0.227×峰7+0.297×峰8-0.364×峰9+0.080×峰10+0.292×峰11+0.037×峰12+0.276×峰13

成分2得分＝-0.328×峰1-0.038×峰2+0.108×峰3+0.462×峰4-0.261×峰5+0.205×峰6-0.280×峰7-0.059×峰8-0.007×峰9+0.462×峰10-0.225×峰11+0.428×峰12+0.160×峰13

成分3得分＝0.036×峰1+0.212×峰2+0.174×峰3+0.002×峰4+0.381×峰5+0.432×峰6+0.208×峰7-0.319×峰8+0.225×峰9-0.071×峰10+0.358×峰11+0.210×峰12+0.467×峰13

其中峰1～峰13表示經Z標準化后的13個共有峰峰面積，將標準化后的值代入線性模型，得到18批菝葜飲片的主成分得分，結果見表5，將3個主成分得分導入Origin 2018軟件，建立三維散點圖（見圖6），結果18批菝葜飲片的空間分布分為三組，表明不同來源菝葜的成分組成上存在一些差異，其中YP1～YP3分布較為接近，YP7～YP10分布較為接近，TP4～YP6、YP11～YP18分布較為接近，與聚類分析結果基本保持一致。

圖6 18批菝葜飲片主成分得分圖Fig 6 Principal component score of 18 batches of Smilax china L.

表5 18批菝葜飲片的主成分得分Tab 5 Principal component scores of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 OPLS-DA 將18批菝葜飲片的共有峰經Z標準化處理后導入SIMCA14.1軟件，建立OPLS-DA數字模型。結果顯示，該模型解釋參數（R2X、R2Y）分別為0.592、0.892，表明模型對變量X（組間差異）、Y（組內差異）的解釋率分別為59.2%、89.2%，Q2為0.791，表明該模型的預測能力可達79.1%[11]。采用 SIMCA 14.1繪制得分矩陣圖，見圖7。可知，18批菝葜飲片可分為3類，YP1～YP3為一類，YP7～YP10為一類，YP4～YP6、YP11～YP18為一類。

圖7 18批菝葜飲片OPLS-DA矩陣圖Fig 7 OPLS-DA matrix of 18 batches of Smilax china L.

采用 SIMCA 14.1 軟件，以Permutations檢驗（n＝200）對建立的OPLS-DA模型進行驗證，詳見圖8，可知，模型參數（R2、Q2）分別為（0，0.083）、（0，-0.586），Q2的回歸線與縱軸相交于0.5以下，表明建立的OPLS-DA模型擬合度好[12]，可用于菝葜飲片質量差異成分的分析驗證。

圖8 OPLS-DA的置換檢驗結果Fig 8 OPLS-DA substitution test

變量投影重要性分析值（VIP）是篩選差異性化合物的重要指標，VIP 值越高，表示其對應化學成分對該模型的貢獻度越大。采用SIMCA 14.1軟件，以VIP值＞1為閾值[13]，篩選影響菝葜飲片質量的標志成分，結果見圖9，共篩選出6 個成分，峰號依次為13號峰、6號峰、3號峰、2號峰（綠原酸）、9號峰（黃杞苷）、8號峰（槲皮苷），表明這6個共有峰所對應的化學成分可能是菝葜飲片質量差異的標志成分。

圖9 18批菝葜飲片共有峰VIP值Fig 9 VIP value of common peak in 18 batches of Smilax china L.

3 討論

3.1 色譜條件優化及供試品制備考察

課題組前期考察了不同流動相體系、色譜柱、柱溫、流速，根據色譜圖信息豐富程度，峰數量以及峰形為條件，最終確定了本文的色譜條件，并在參考文獻[14-15]的基礎上結合對供試品溶液的制備方法進行考察（不同濃度的溶劑、提取方式、提取時間進行考察），最終發現在70%的甲醇下超聲45 min時的供試品溶液中各成分含量最高。

3.2 共有峰指認及存在的不足

18批不同來源的菝葜飲片共標定了13個共有峰，指認出5個成分，分別為綠原酸、落新婦苷、槲皮苷、黃杞苷、白藜蘆醇。不足之處在于仍然有7個成分未被指認，后期將通過液-質聯用技術，解析未被指認的共有峰的化學成分以及改用UPLC建立指紋圖譜，縮短分析時間。

3.3 多模式化學計量學分析

聚類分析、主成分分析、OPLS-DA可以準確地分析不同來源菝葜之間的差異，從結果來看，三類分析結果一致，其中YP1～YP3為一類，YP7～YP10為一類，YP4～YP6、YP12～YP18為一類，表明不同來源的菝葜飲片的化學組成沒有明顯的地域性，質量較為穩定。

綜上本研究建立了不同來源菝葜飲片的HPLC指紋圖譜，通過多模式化學計量學分析對飲片進行綜合評價，該結果可為菝葜飲片的質量評價及控制提供參考。