基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術的血平片化學成分及指紋圖譜的研究

梁國嬪，周朝忠，康興東，李晶，夏淑英，李小鋒

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100

血平片處方中包括地黃、三七、海螵蛸、熟大黃、茜草、地榆和炒蒲黃等藥材，具有清熱化瘀、止血調經的功效。血平片在臨床上常用于治療因挾瘀所致的崩漏［1］。目前血平片的質量控制主要以大黃和三七的含量測定為主，缺少對血平片整體的質量控制［2］。中藥及其制劑成分極其復雜且多樣，對中藥質量評價難度也較大。目前超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道阱質譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS）技術在中藥的化學成分分析方面有著快速、高效等特點被廣泛應用于中藥的物質基礎研究，而中藥指紋圖譜技術可在中藥化學成分研究的基礎上提供豐富的信息，進而整體地評價中藥制劑的質量［3-5］。

血平片處方中的三七含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1［6-7］以及地榆中含有的地榆皂苷-Ⅱ［8］等成分多為紫外末端吸收的成分，僅使用紫外檢測器無法檢測出這些成分。蒸發光散射檢測器廣泛用于無紫外吸收或末端吸收的有機物質，如人參皂苷、黃芪甲苷等，是一種通用型檢測器。因此本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術和對照品比對鑒定血平片主要成分的基礎上，采用高效液相色譜法聯合紫外檢測器（HPLC-UV）與蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）建立方便可行的指紋圖譜方法，為血平片的質量控制提供客觀有效的評價方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695-2996-ELSD 液相色譜儀（美國Waters 公 司）；Ultimate 3000 超 高效液相色譜系統-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質聯用譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；島津LC20A-ELSD 液相色譜儀（日本島津公司）；BSA124S-CW 電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；9960D 超聲波清洗儀（CBL 科貝爾）；Mili-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 材料

毛蕊花糖苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、地榆皂苷-Ⅱ、香蒲新苷對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（批號分別為111530-201914、110756-201913、110795-201710、110757-201607、110796-201922、110758-201817、110745-201921、110703-201933、110704-202028、111952-201301、111573-201806）；13 批血平片樣品均由江西普正制藥股份有限公司生產和提供；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；水為自制超純水。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別稱取大黃素、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、大黃酸、人參皂苷Rb1、大黃酚、地榆皂苷-Ⅱ、大黃素甲醚、香蒲新苷適量，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取血平片20 片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，取粉末約2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 液相色譜-質譜聯用條件

2.3.1 色譜條件采用XBridge BEH C18 色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.5 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，5%→95%B；20～45 min，95%B；45～60 min，95%→5%B），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

2.3.2 質譜條件使用賽默飛HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質聯用儀進行樣品檢測。儀器校正后誤差<5 ppm，電噴霧離子源采用正、負離子模式進行數據采集。以普通氮氣為輔助氣和鞘氣，高純氮為碰撞氣。采用Full MS/dd-MS2（Top3）正負切換同時采集，觸發前三強母離子的二級掃描，碰撞能量NCE 設置為：20、40、60；掃描范圍：150～1 500；裂解電壓：3.2 kV；鞘氣：40 psi；輔助氣流量：10 arb ；離子傳輸管溫度：320 ℃；一級質譜分辨率：70 000FWHM ；二級質譜分辨率：17 500FWHM。數據采集軟件采用Xcalibur2.1。

2.4 指紋圖譜色譜條件

采用ODS C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，20% B；5～45 min，20%→48%B ；45～60 min，48% →61% B ；60～90 min，61%→98% B）；柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm；ELSD 溫度60 ℃；氮氣壓力350 kPa；增益值6/32 倍。

3 結果

3.1 血平片的主要成分分析

在擬定的分析條件下，血平片在正、負離子模式下的總離子流圖見圖1。根據得到的高分辨質譜提供的一級準分子離子峰和二級質譜碎片離子峰的精確m/z 信息，確證了有關物質及特征碎片的化合物結構信息。通過已有的數據庫和對照品的相關的文獻［6-18］資料，共鑒定或推斷41 種主要化學成分，鑒定結果見表1。初步闡明了血平片的物質基礎信息，為建立信息量豐富的血平片指紋圖譜提供便利。

圖2 13批血平片HPLC指紋圖譜共有模式（UV 254 nm）

表1 血平片中主要化學成分鑒定

3.2 指紋圖譜的建立與分析

3.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評價取13 批次血平片樣品，按“2.2”項下方法分別制備供試品溶液，進樣測定，將所得圖譜導入“評價系統”進行計算，得到13 批樣品的相似度值，見表2。樣品相似度范圍為0.903～0.990，說明13 批血平片的批間質量穩定性良好。13 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式圖見2、圖3，生成的對照指紋圖譜見圖4、圖5。

圖4 血平片對照指紋圖譜（UV 254 nm）

圖5 血平片對照指紋圖譜（UV 254 nm）

表2 不同批次血平片HPLC指紋圖譜相似度

3.2.2 精密度試驗按“2.2”項下方法制備血平片（批號150902）供試品溶液，連續進樣6 次，將所得圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”（以下簡稱“評價系統”），結果其相似度均在0.98 以上。并且在UV、ELSD 條件下分別以17、23 號特征峰為參照峰，各特征峰相對保留時間RSD值分別為0.11%、0.17%，相對峰面積RSD 值分別為1.83%、1.20 %，表明該方法精密度良好。

3.2.3 重復性試驗按“2.2”項下方法平行制備6份血平片（批號150902）供試品溶液，分別測定，將所得圖譜導入“評價系統”，結果相似度均在0.95以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號特征峰為參照峰，各特征峰相對保留時間RSD 值分別為1.18%、0.10%，相對峰面積RSD 值分別為1.66%、0.38%，表明該方法重復性良好。

3.2.4 穩定性試驗取“3.2.1”項下供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 測定，將所得圖譜導入“評價系統”，結果相似度均在0.98 以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號特征峰為參照峰，各特征峰相對保留時間RSD 值分別為0.13%、0.08%，相對峰面積RSD 值分別為2.14%、0.81%，表明該供試品在24 h 內穩定。

4 討論

本研究首次采用 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術對血平片的化學成分定性分析，基于分析結果對指紋圖譜起到了指導作用。指紋圖譜同時采用HPLC-UV 和HPLC-ELSD 全面對血平片特征峰信息表征，從整體性方面體現了獨特的優勢［3］。該技術具有快速、高效地對中藥的化學成分進行定性分析的優勢，指紋圖譜能夠全面地反映中藥的整體質量。采用高分辨質譜技術結合指紋圖譜技術對血平片的物質基礎進行研究，與現有的血平片等含三七制劑的質量控制方法［1-2］相比，能顯示更多的特征峰信息，能有效地表征其質量，也為血平片后續的質量控制與藥效研究提供了物質信息基礎。

在血平片指紋圖譜的建立方面考察了提取溶劑、提取方式等因素，篩選出最佳制備方法，最終采用以70%甲醇加熱回流2 h 的提取方法。

本研究建立的指紋圖譜進行了精密度、重復性、穩定性試驗，確定了方法的可行性；通過對共有峰的確認與各藥材相關聯，方便對處方中大部分藥材進行鑒別，但其中海螵蛸中的成分信息在血平片中展現較少，可能是因為物質特性、提取方式等原因導致。

本研究應用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術對血平片的主要化學成分進行分析鑒定，對血平片藥效物質基礎的闡明提供了重要依據，但其作用機制仍需進一步研究和驗證。