LC-MS/MS 法監控阿齊沙坦原料中帶警示結構的疊氮化雜質殘留風險

郭招娣，趙甜，許紅霞，郭鑫，趙小君，諶宗永，馬昂，劉宇晶，王明娟

北京陽光諾和藥物研究股份有限公司，北京 102200

阿齊沙坦（azilsartan）是新一代選擇性AT1 亞 型血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker,ARBs）類抗高血壓藥，與血管緊張素轉化酶抑制劑類降壓藥物相比，具有平穩降壓及不會干咳的優點［1-2］。基因毒性雜質（genotoxic impurities）或致突變雜質（mutagenic impurities)，指在較低水平時也有可能直接引起DNA 損傷，導致DNA 突變，從而可能引發癌癥的遺傳毒性雜質，是影響用藥安全的關鍵風險因素，需要重點關注［3-7］。基因毒雜質可能來源于原料藥合成工藝中的起始原料、工藝中間體、反應副產物或溶劑、試劑、催化劑等［3］。根據本研究中使用的阿齊沙坦候選原料的合成路線，在步驟3 中使用了疊氮化鈉，而步驟4 中又使用了4-溴甲基-2'-氰基聯苯，有可能會與上一步驟中殘留的微量疊氮化鈉發生反應，如圖1 所示，產生帶警示結構的疊氮雜質AMBC｛4'-(azidomethyl)［1,1-biphenyl］-2-cyanyl，4'-(疊氮甲基)［1,1-聯苯］-2-氰基｝，故需要對該雜質的殘留風險進行評估。

圖1 阿齊沙坦合成路線中AMBC雜質可能的產生途徑示意圖

疊氮化物通過抑制細胞色素C 氧化酶引起毒性效應，會導致頭暈、低血壓、代謝性酸中毒、呼吸抑制等，甚至死亡［8-12］，因此非常有必要對藥品中疊氮化物的殘留水平進行嚴格監控。本研究重點探討AMBC 雜質殘留水平的監控（疊氮化鈉與AMBC結構差異較大，會采用另外一個系統監控）：AMBC屬于帶疊氮化警示結構的雜質、無致畸性報道、與藥物活性成分阿齊沙坦的結構有較明顯差異，按照人用藥品注冊技術國際協調會議（ICH）M7 分類原則，應歸屬為3 類基因毒性雜質［3］；按照ICH M7指南控制策略，需要將該類雜質的殘留水平控制在毒理學關注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）以下；按照最嚴苛的長期治療方案（使用時間>10 年）、終生患癌風險為十萬分之一假設，AMBC 雜質的TTC 值采用了1.5 μg/d，阿齊沙坦的每日最大用藥劑量為40 mg，故阿齊沙坦中AMBC 的限度設定為37.5 ppm（即：1.5 μg/d÷40 mg/d×1 000 μg/mg=37.5 ppm）。

在痕量疊氮化物雜質的監控中，常采用離子色譜法［8-12］；在提升痕量疊氮化物的檢測靈敏度方面，文獻中曾報道了柱切換在線基體消除法［11］、磁化陰離子交換金屬-有機骨架富集技 術（magnetized anion-exchange metal-organic frameworks）［12］、五氟芐基衍生-氣相色譜（GC-MS）法［13］等。本研究首次成功采用靈敏度、專屬性均很理想的串聯質譜技術［14-17］，對阿齊沙坦原料中的痕量AMBC 殘留風險進行了監控，以保障新藥研發過程中所使用的阿齊沙坦原料及其制劑的用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-MS/MS 質譜儀（型號：API 4000，AB SCIEX公司）；超聲波清洗器（KH-600，昆山禾創超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（AP225WD，日本島津公司）。

1.2 試藥、對照品和樣品

水（蒸餾水，屈臣氏）；乙腈（色譜純，MREDA 公司）；乙酸銨（色譜純，MREDA 公司）；雜質AMBC 對照品（純度99.6%，STD 公司）；阿齊沙坦原料（批號：C1011-200501，C1011-200502，C1011-200503，浙江宏元藥業股份有限公司）；阿齊沙坦原料合成工藝步驟6 的工藝中間體C6 樣品（屬于目標雜質AMBC 產生后可能殘留的關鍵工藝中間體，批號：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403，浙江宏元藥業股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件液相色譜：采用ACE Excel 3 C18 柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫為40 ℃；流動相A 為0.01 mol/L 乙酸銨溶液-乙腈（90∶10），流動相B 為乙腈，梯度洗脫：0～6.0 min,20%→90% B；6.0～11.0 min,90% B；11.01 min，90%→20% B 并維持至16 min，總流速為0.5 mL/min，進樣體積為10 μL。

質譜條件：采用API 4000 三重四極桿串聯質譜儀，大氣壓化學電離-正離子掃描（APCI+），多反應監測模式（MRM），探頭溫度：450 ℃，電暈針電流：3.0 μA，氣簾氣：35 psi，碰撞氣：4 psi，霧化氣：45 psi；用雜質AMBC 的特征離子對207.3 →180.3 進行定量監測。

1.3.2 溶液配制（1）溶劑：采用80%乙腈。

（2）AMBC 對照品溶液：取AMBC 對照品約10 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加溶劑溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取100 μL 置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為AMBC 對照品溶液（約100 ng/mL，相當于供試品溶液濃度的33.3 ppm）。

（3）供試品溶液：取樣品約30 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，混勻，即得（3 mg/mL）。

各溶液配制后，應置于冷藏條件下保存。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性取“1.3.2”項下的空白溶劑、AMBC對照品溶液、供試品溶液，依次進樣分析，記錄色譜圖，見圖2。結果顯示：空白溶液與樣品基質（阿齊沙坦的出峰時間約為7.3 min）均不會對目標雜質AMBC（保留時間約為9.3 min）的檢測造成干擾，且AMBC 的峰形較好，證明擬定方法的專屬性較好。

圖2 典型LC-MS/MS圖：A.空白溶劑；B.AMBC對照品溶液；C.樣品溶液

2.1.2 定量限與檢測限分別以信噪比（S/N）約為3 和10 作為AMBC 的檢測限（LOD）與定量限（LOQ）判定標準。取AMBC 對照品溶液，用溶劑進行逐級稀釋，確定的檢測限（S/N 為6～7）約為0.062 ng/mL（相當于供試品溶液濃度的0.021 ppm），定量限（S/N 為12～16）約為0.21 ng/mL，相當于供試品溶液濃度的0.07 ppm，遠低于AMBC 擬定限度（37.5 ppm），證明方法的檢測靈敏度非常理想。

取定量限濃度水平的對照品溶液，重復進樣，AMBC 峰面積的RSD 為2.8%（n=6），證明方法在定量限水平時的進樣精密度較好。

2.1.3 進樣精密度取“1.3.2”項下的AMBC 對照品溶液，重復進樣6 針，AMBC 保留時間和峰面積的RSD 分別為0.1%和1.6%，證明方法的進樣精密度較好。

2.1.4 重復性平行配制6 份100%限度水平的加標供試品溶液考察方法的重復性，結果表明：6 份樣品中AMBC 雜質含量測定結果RSD 為1.5%，表明方法的重復性良好。

2.1.5 線性關系考察分別配制相當于“1.3.2”項下AMBC 對照品溶液濃度（100 ng/mL）10%、50%、100%、150%、200%和300%的溶液（實際濃度介于10.4～312.2 ng/mL 范圍，相當于3.5～104.1 ppm），用“1.3.1”項下色譜條件考察方法的線性響應情況，結果表明：在能夠覆蓋擬定限度水平（37.5 ppm）的上述濃度范圍內，雜質AMBC 的峰面積（Y）與溶液濃度（X）呈良好的線性響應，線性回歸方程為Y=7 002X+16 571，r=0.999 8 。

2.1.6 準確度在雜質AMBC 限度（100 ng/mL）的50%、100%、150%三種添加水平下進行擬定LCMS/MS 方法的準確度考察，每種濃度水平分別平行配制三份溶液，加樣回收率結果如表1 所示：9 份加標樣品中，雜質AMBC 的加樣回收率介于100.2%～104.2%，均在規定范圍內［18］，證明樣品溶液的前處理適宜、樣品基質不會干擾目標雜質AMBC 的準確測定。

表1 用擬定方法測得的AMBC雜質的加樣回收率結果

2.1.7 溶液穩定性將對照品溶液、100%加標供試品溶液在10 ℃條件下放置，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣分析，結果表明：上述2種溶液在12 h之內，雜質AMBC 峰面積的RSD%分別為1.79%和1.71%，說明兩種溶液在10 ℃條件下，至少12 h 內穩定。

2.2 樣品分析

利用上述經過驗證的串聯質譜方法對3 批阿齊沙坦原料進行了檢測，檢測結果見表2。3 批樣品中均未檢測出AMBC 雜質（<0.021 ppm），說明采用擬定合成和純化工藝能夠有效避免阿齊沙坦原料中AMBC 的殘留風險。

表2 阿齊沙坦原料中AMBC的殘留量檢測結果 ppm

采用該方法，對3 批工藝中間體（步驟6）樣品（批號：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403）也進行了檢測，結果表明：這些工藝中間體中AMBC 殘留水平均低于檢測限（<0.021 ppm），進一步驗證了候選阿齊沙坦原料采用的合成和純化工藝能夠有效避免殘留疊氮化雜質AMBC。

3 討論

AMBC 雜質屬于殘留風險較大的工藝副產物，帶疊氮化警示結構，殘留水平要求非常苛刻，故采用了靈敏度較高的液相-串聯質譜技術進行了方法開發。在方法建立階段，對AMBC 雜質的定量離子和定性離子進行了篩選，并且針對性優化了離子源參數及碰撞電壓，優化后的LC-MS/MS 法的最低檢測限（0.021 ppm）甚至低于限度要求（37.5 ppm）的千分之一，能夠充分滿足方法的檢測靈敏度要求，而且方法的準確度、線性、專屬性、重復性也均很理想，能較好地滿足阿齊沙坦原料及其工藝中間體中痕量AMBC 的殘留風險評估。另外，需要注意的是：目標雜質AMBC 在溶液狀態下，如果在室溫條件下進樣，穩定性會受到影響；若將進樣溫度設定在10 ℃，其溶液的穩定性在12 h 之內有保障，故建議各溶液配制后置于冷藏條件下保存。

目前，尚未查詢到阿齊沙坦中AMBC 雜質的檢測方法報道。本方法的建立將為具有類似警示結構的疊氮類雜質的殘留風險監控提供很好的借鑒。

4 結論

本研究采用串聯質譜技術，首次建立了能夠用于阿齊沙坦原料中帶疊氮化合物警示結構的AMBC雜質殘留量檢測的方法，所建的方法靈敏度高、專屬性強、準確度高，在能夠覆蓋限度水平的較寬濃度范圍內呈良好的線性關系，方法的進樣精密度、重復性均很理想，能夠較好地滿足阿齊沙坦原料中痕量AMBC 雜質的殘留量檢測需求，有效地保障了阿齊沙坦原料及其制劑的用藥安全。