細菌在兩種容器的乙醇酸鹽流體培養基中生長差異性探討

李趣嫦，江艷芳，賴珊

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663

硫乙醇酸鹽流體培養基為藥品無菌檢查法中用于培養厭氧菌和需氧菌的培養基。查閱《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015、2020年版［1-2］及相關文獻［3-6］，藥品無菌檢查一般采用直接接種法和薄膜過濾法兩種方法。直接接種法為取規定量供試品接種至裝量不少于15 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨液體培養基的試管中進行培養觀察。薄膜過濾法則是取規定量供試品，用一次性封閉式薄膜過濾器進行過濾沖洗，濾干后在薄膜過濾器里加入體積為100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨液體培養基進行培養觀察。本文研究5 種細菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌）在一次性封閉式薄膜過濾器與試管的硫乙醇酸鹽流體培養基中生長是否存在差異，旨在為檢測機構和藥品生產廠家提供參考，更好地監測和保障無菌檢查的科學性和真實性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BRE240 型生化培養箱（法國Froilabo 公司）；Thermo Scientific 1300 Series A2 型生物安全柜（美國賽默飛世爾科技）；Lab dancer 漩渦混合器(德國IKA 艾卡集團）；WJ-6 無菌檢查儀（天津羅根科技）；NS01-3 型一次性封閉式薄膜過濾器（北京牛牛科技）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10 104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64 941］和洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）［CMCC（B）23 005］均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養基

胰酪大豆胨液體培養基(批號：1086401)、硫乙醇酸鹽流體培養基(批號：1091325)、胰酪大豆胨瓊脂(批號：2002202)均購自北京三藥科技有限公司；哥倫比亞瓊脂養基(批號：1082711)購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 試藥

自編號1～8 的硫乙醇酸鹽流體培養基生產廠家及批號分別為：1.北京三藥科技有限公司，1 091325；2.廣東環凱微生物科技有限公司，1 095281；3.北京鴻潤寶順科技有限公司，201110；4.青島高科技工業園海博生物技術有限公司，20 201107；5.北京奧博星生物技術有限責任公司，20 201208；6.北京陸橋技術股份有限公司，201107；7.Becton，Dickinson and Company，0 048064；8.默克股份兩合公司，654833。培養基1～8 均為脫水培養基。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌的新鮮培養物，按照《中國藥典》2020 年版制備成濃度為10～100 cfu/mL 的菌懸液；取上述菌懸液，按十倍稀釋法稀釋制成1～10 cfu/mL 的菌懸液。

2.2 菌液的計數

取上述制備好的濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的各菌懸液各1 mL 注入平皿中，其中接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌菌懸液的平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂，置32.5 ℃培養；接種生孢梭菌菌懸液的平皿傾注哥倫比亞瓊脂，置32.5 ℃厭氧培養，平行制備2個平皿，測定各菌懸液的菌落數（表1）。

表1 菌液計數結果

2.3 生長情況檢查

實驗前先測量各廠家培養基的氧化層高度和培養基的總高度，計算二者比值，結果均符合《中國藥典》2020 年版的規定（表2）。然后取一次性薄膜過濾器，分別加入8 個廠家的硫乙醇酸鹽流體培養基，裝量為100 mL、50 mL；另取無菌試管，加入上述培養基，裝量為15 mL。各廠家的培養基每個不同的裝量各制備21 支，分別接種濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和洋蔥伯克霍爾德菌的菌懸液，各菌株兩個濃度各接種2 管，另取1 管不接種作為空白對照，置32.5 ℃培養3 d，每株菌共4 管均生長良好判為該培養基通過。重復實驗3 次，以保證實驗的重現性。

表2 氧化層測量結果

2.4 結果

一次性薄膜過濾器裝量50 mL 及試管裝量15 mL，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 中，5 種細菌在規定時間內均生長良好；一次性薄膜過濾器裝量100 mL，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL，5 種細菌在規定時間內也均生長良好。而在一次性薄膜過濾器裝量100 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL的生長檢查中，8 批次中有2 批次的銅綠假單胞菌不生長（表3），有3 批次的枯草芽孢桿菌不生長（表4）。

表3 銅綠假單胞菌（1～10 cfu/mL）生長情況結果

表4 枯草芽孢桿菌（1～10 cfu/mL）生長情況結果

3 討論

在本研究中，硫乙醇酸鹽流體培養基生長試驗除了使用《中國藥典》2020 版中靈敏度檢查規定的3 個菌株外，還加入了枯草芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌，原因為枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌類細菌，該類細菌在生長環境不利的條件下可轉為芽孢，污染藥品后很難對其殺滅；而洋蔥伯克霍爾德菌為條件致病菌，為最近幾年研究熱點，易在制藥行業中水系統生存，藥品生產中易受到其污染［7-10］，故增加這兩株菌作為生長檢查的挑戰菌株。

在本研究結果中，5 種細菌在一次性薄膜過濾器裝量為100 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL 的生長檢查中，8 批次培養基中有2 批次的銅綠假單胞菌不生長，有3 批次的枯草芽孢桿菌不生長，通過率為38%。而在試管裝量為15 mL，菌懸液濃度為1～10 cfu/mL 的生長檢查通過率為100%。所有廠家的硫乙醇酸鹽流體培養基按照藥典方法，用試管裝量為15 mL 做生長檢查試驗，菌懸液濃度為10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 均能全部通過，說明所有廠家的培養基質量是符合現行藥典規定。故結果存在差異主要原因分析為：一次性薄膜過濾器裝量為100 mL 與其裝量為50 mL 和試管裝量為15 mL 的培養基用量和高度不一致，裝量為15 mL 的試管和裝量為50 mL 過濾器的培養基的容器內部空氣含量較大，含氧總量比裝量為100 mL 的過濾器多；且裝量為15 mL 的試管和裝量為50 mL 過濾器的培養基的體積較少，培養基的氧化層更容易受到氧氣的影響。而硫乙醇酸鹽流體培養基會根據含氧量調節氧化層，從而導致培養系統不一致。這可從裝量為100 mL 的一次性薄膜過濾器生長檢查不通過的菌株為需氧菌類的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌可推斷。故在使用硫乙醇酸鹽流體培養基時按實際選取恰當的容器考察其生長，必要時增加產品易受污染的菌株或環境分離的菌株考察其生長情況，以降低無菌檢查中硫乙醇酸鹽流體培養基假陰性出現的概率。