LncRNA LINC01194在非小細胞肺癌中對miR-302e的影響及機制研究

馬 翾, 劉 洋, 劉娟娟, 田 浩, 李 杰

(1.三峽大學附屬第二人民醫院/宜昌市第二人民醫院腫瘤外科中心, 湖北 宜昌 443000 2.湖北省第三人民醫院腫瘤科, 湖北 武漢 430030)

肺癌是全球最常見的惡性疾病之一,其發病率和死亡率高,非小細胞肺癌(NSCLC)是其主要病理類型,約占肺癌的80%[1-2]。關于NSCLC的治療,目前以外科手術、放化療等為主,分子靶向治療雖然取得了明顯的進步,但仍是當前研究的難點[3-4]。因此,需進一步探索潛在的治療靶點,為NSCLC的治療提供新思路。長鏈非編碼RNA(lncRNA)對多種癌癥的生物學進程具有調控作用。研究發現,lncRNA LINC01194在肝細胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細胞癌中異常高表達,并能促進癌癥的發生發展[5-6]。Xing等[7]研究結果顯示,lncRNA LINC01194在NSCLC組織和細胞中高表達,并通過調節miR-486-5p/CDK4軸促進NSCLC的增殖和遷移,但在NSCLC中的作用仍需進一步研究。經生物信息學分析顯示,lncRNA LINC01194與miR-302e存在靶向關系,miR-302e在多數腫瘤中發揮抑癌基因作用。研究顯示,miR-302e在NSCLC中異常低表達,其降低與侵襲性、不良預后密切相關,過表達miR-302e明顯抑制NSCLC增殖[8]。推測lncRNA LINC01194可能通過調節miR-302e影響NSCLC的發生發展。因此,本研究主要探究lncRNA LINC01194對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響,以期為NSCLC的靶向治療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1標本收集和細胞來源:收集2022年1月至2022年12月在我院手術治療并經病理明確診斷為NSCLC新發病例的18對新鮮肺癌組織、癌旁組織,標本迅速放置液氮內冷凍保存。所有入組患者術前均未接受任何化療、放療、靶向治療及免疫治療等,且簽署了知情同意書,本研究獲得本院倫理委員會的批準。人肺正常上皮細胞BEAS-2B及人NSCLC細胞系NCI-H1975、A549、H1299、H460購于美國ATCC。

1.2主要試劑與儀器:MTT細胞增殖檢測試劑盒(M1020)北京solarbio;實時熒光定量PCR試劑盒(11184ES03)上海Yeasen;兔源一抗PCNA、Bax、Bcl-2、MMP-2、GAPDH(ab152112、ab182733、ab203516、ab37150、ab9485)以及HRP標記的羊抗兔二抗IgG(ab6721)美國Abcam公司;多功能酶標儀(LD-96A)山東萊恩德智能科技有限公司;實時熒光定量PCR儀(QuantStudio 7 Flex)美國ABI;光學顯微鏡(CX31)日本olympus;流式細胞儀(NOVOCYTE3130)美國艾森公司。

1.3方 法

1.3.1細胞培養及轉染:將BEAS-2B、NCI-H1975、A549、H1299、H460接種至DMEM培養基進行傳代培養,培養48h后,檢測細胞lncRNA LINC01194、miR-302e表達水平。取對數生長期的NCI-H1975細胞,按照1.2×106個接種于6孔板中,使用轉染試劑盒進行轉染,根據質粒將細胞分為control組、si-NC組、si-LINC01194組、si-LINC01194+anti-miR-NC組、si-LINC01194+anti-miR-302e組,轉染48h后檢驗轉染效率并進行后續實驗。

1.3.2qRT-PCR檢測lncRNA LINC01194、miR-302e表達:提取組織和細胞的總RNA、反轉錄后以cDNA為模板配置qRT-PCR反應體系。lncRNA LINC01194上游引物:5'-AGGCCTGACACGTTTACTAA-3'和下游引物:5'-AGGCCTGACACGTTTACTAA-3';miR-302e上游引物:5'-CTCATCGCATAAGTGCTTCCAT-3'和下游引物:5'-TATCGTTGTTCTCGACTCCTTCAC-3';GAPDH上游引物:5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'和下游引物:5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';qRT-PCR反應體系:SYBR?Green PCR Master Mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA模板1μL、ddH2O 7μL;qRT-PCR反應程序:95℃預變性1min,95℃變性5s、56℃退火10s、72℃延伸30s、40個循環。lncRNA LINC01194、miR-302e分別以GAPDH、U6為內參,以2-ΔΔCT法計算組織和各組細胞中相對表達量。

1.3.3細胞增殖檢測:各組細胞在96孔板上接種,濃度為1×104個/孔,設6個復孔。隨后進行常規培養24、48、72h后每孔加入20μL MTT溶液。繼續培養4h每孔再加入150μL的二甲基亞砜,在酶標儀上于490nm波長處檢測各孔的OD值。收集培養結束的各組細胞,接種在6孔板(1×103個/孔)中,培養10d,期間及時更換培養基,用4%多聚甲醛固定細胞,并用結晶紫染色,水洗,干燥、計數細胞數>50個的克隆數。

1.3.4細胞遷移與侵襲實驗:轉染后的NCI-H1975細胞生長至對數期時,使用涂有Matrigel基質膠的Transwell小室進行侵襲實驗,遷移實驗未涂有Matrigel基質膠,各組細胞取200μL(2×105)細胞懸液加入上室,下室加入600μL含10% FBS的DMEM培養基,培養24h,固定染色,顯微鏡下隨機選取5個視野計算穿膜細胞數。

1.3.5細胞凋亡檢驗:首先收集各組細胞,然后用預冷過的PBS沖洗2次,隨后加入100μL 1×結合緩沖液進行重懸,最后加入5μL的Annexin V-FITC和PI染液,充分混勻。在室溫下遮光染色15min,最后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.6PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白檢測:采用Western blot法檢測PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達,PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2及GAPDH一抗稀釋液按照1∶1500稀釋,HRP標記的二抗按照1∶1000稀釋,實驗結束后,以GAPDH為內參,采用Image J軟件分析各蛋白表達。

1.3.7雙熒光素酶活性檢測:分別構建含有lncRNA LINC01194野生型(wt)與突變型(mut)表達載體,將突變位點克隆至PmirGLO載體,將lncRNA LINC01194-wt、lncRNA LINC01194-mut分別與miR-NC、miR-302e mimics共轉染NCI-H1975細胞48h,熒光素酶報告分析系統檢測相對熒光素酶活性。

2 結 果

2.1LINC01194、miR-302e在組織和細胞中的表達:與癌旁組織比較,NSCLC組織中LINC01194表達水平升高,miR-302e表達降低,差異有統計學意義(t=39.949、29.498,P<0.05)見表1;與BEAS-2B細胞比較,LINC01194在NCI-H1975、A549、H1299、H460表達水平顯著升高,miR-302e表達顯著降低,差異有統計學意義(F=224.901、261.531,P<0.05),且在NCI-H1975細胞中LINC01194表達水平最高,miR-302e表達水平最低,選擇NCI-H1975細胞進行后續實驗,見圖1。

圖1 LINC01194、miR-302e在細胞中的表達

表1 LINC01194 miR-302e在組織中的表達

2.2敲低LINC01194對NCI-H1975細胞中LINC01194、miR-302e表達的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細胞中LINC01194表達水平降低,miR-302e表達水平升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細胞miR-302e表達水平降低,差異均有統計學意義(F=151.274、75.012,P<0.05),見圖2。

圖2 各組NCI-H1975細胞中LINC01194、miR-302e的表達比較

2.3敲低LINC01194對NCI-H1975細胞增殖能力的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細胞OD490值、集落形成數顯著降低(P<0.05);與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細胞OD490值、集落形成數顯著升高(P<0.05),見圖3和表2。

圖3 各組細胞集落形成數比較

表2 各組NCI-H1975細胞OD490值集落形成數比較

2.4敲低LINC01194對NCI-H1975細胞遷移與侵襲能力的影響:與si-NC組(173.58±9.26)個、(136.94±8.35)個比較,si-LINC01194組遷移與侵襲細胞數(67.98±8.15)個、(56.31±7.25)個顯著降低;與si-LINC01194+anti-miR-NC組(69.32±8.37)個、(58.96±7.78)個比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組遷移與侵襲細胞數(135.48±8.92)個、(117.62±7.67)個顯著升高,差異均有統計學意義(F=206.148、162.852,P<0.05),見圖4、圖5。

圖4 各組細胞遷移與侵襲情況比較(100×)

圖5 各組NCI-H1975細胞遷移與侵襲數比較

2.5敲低LINC01194對NCI-H1975細胞凋亡的影響:與si-NC組(6.72±1.48)%比較,si-LINC01194組NCI-H1975細胞凋亡率(47.85±4.46)%顯著升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較(45.92±4.38)%,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細胞凋亡率(17.69±2.45)%顯著降低(F=259.881,P<0.05),見圖6、圖7。

圖6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖7 各組NCI-H1975細胞凋亡率比較

2.6敲低LINC01194對PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細胞PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,Bax蛋白表達水平顯著升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細胞PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高,Bax蛋白表達水平顯著降低,差異均有統計學意義(F=269.263、126.999、151.765、212.684,P<0.05),見圖8、圖9。

圖8 Western blot檢測細胞中PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達

圖9 各組NCI-H1975細胞中PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達比較

2.7LINC01194與miR-302e靶向關系驗證:經starBase在線分析顯示,LINC01194與miR-302e存在靶向結合位點,見圖10;雙熒光素酶實驗顯示,LINC01194-wt與miR-302e mimics共轉染NCI-H1975細胞后,與miR-NC比較,相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖11。

圖10 LINC01194與miR-302e的結合位點與突變位點

圖11 雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果

3 討 論

LncRNA是一類新發現的非編碼RNA,可作為癌基因或腫瘤抑制因子發揮作用,從而調節癌細胞的生長增殖等行為。lncRNA LINC01194可作為關鍵的癌基因并促進腫瘤進展。研究發現,lncRNA LINC01194在結直腸癌中作為癌基因,通過激活上皮-間充質轉化,促進結腸癌細胞的增殖和遷移能力,與不良生存結果相關[9]。lncRNA LINC01194在癌組織和癌細胞中高表達,并通過調控miR-655-3p/SMAD、miR-486-5p/GOLPH3、miR-655/SOX18促進肝細胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細胞癌的發生發展,抑制lncRNA LINC01194表達可顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲。Meng等[10]研究發現,lncRNA LINC01194通過靶向miR-641/SETD7軸促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。以上研究表明,lncRNA LINC01194在結腸癌、肝細胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細胞癌、肺腺癌等腫瘤中具有致癌作用。本研究發現,lncRNA LINC01194在NSCLC組織中和NCI-H1975、A549、H1299、H460細胞中高表達,抑制lncRNA LINC01194表達可顯著抑制NCI-H1975細胞增殖、遷移與侵襲,降低NCI-H1975細胞中PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達水平,提高Bax蛋白表達水平、促進細胞凋亡。提示lncRNA LINC01194在NSCLC中同樣發揮抑癌基因的作用,與前人研究結果一致。

lncRNA可作為競爭性內源RNA或miRNA"海綿"來調節腫瘤中關鍵基因,從而發揮腫瘤抑制或腫瘤促進功能。本研究通過生物信息學分析、雙熒光素酶報告實驗證實miR-302e可與lncRNA LINC01194靶向結合。miR-302e被證明是一種腫瘤抑制因子,在結直腸癌組織和細胞中下調表達,過表達miR-302e可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲,但促進細胞凋亡,CXCL1被確定為miR-302e的直接靶標,CXCL1可以逆轉miR-302e對細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響[11]。VEGFA是血管內皮細胞的生長和存活因子,可以通過誘導血管生成和激活基質金屬蛋白酶來增強細胞侵襲,并提高細胞活力,在卵巢癌在內的多種腫瘤中過度表達,而miR-302e可靶向下調VEGFA的表達,抑制卵巢癌的發展[12]。miR-302e靶向調節CDCA7表達,調控結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲[13]。本研究顯示,miR-302e在NSCLC組織和細胞中低表達,抑制LINC01194可促進NCI-H1975細胞中miR-302e表達,而抑制miR-302e表達可逆轉抑制lncRNA LINC01194表達對NCI-H1975細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用,及對細胞凋亡的促進作用。推測抑制lncRNA LINC01194可能通過上調miR-302e表達,從而抑制NSCLC細胞增殖、遷移與侵襲,促進其凋亡。

綜上所述,在NSCLC組織和細胞中lncRNA LINC01194上調表達,miR-302e下調表達,抑制lncRNA LINC01194可通過上調miR-302e表達,從而抑制NSCLC細胞增殖、遷移與侵襲,促進其凋亡。lncRNA LINC01194/miR-302e可能成為治療NSCLC的一種新靶點。然而本研究尚存在不足之處,僅驗證LncRNA LINC01194對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的作用,而未對其他靶點和通路進行驗證,這些將是后續研究內容。