miR-29b-3p和FOXO3A在結腸癌組織中的表達及臨床意義

李博文, 韓元圣, 黃高俊, 鄭 磊

(湖北省當陽市人民醫院普外科, 湖北 當陽 444100)

結腸癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,具有較高發病率和死亡率。研究顯示,60%的結腸癌會導致轉移,最常轉移的器官有肝臟(40%)、肺(15%)或兩者皆有(10%)[1]。化療和手術切除是臨床治結腸癌的主要方式,但半數患者易出現局部或遠處復發。因此,早期識別結腸癌至關重要。篩選新的分子生物標志物有助于開發有效、敏感和可靠的臨床檢測結腸癌方法,方便早期診斷和設計精準有效的治療策略,改善預后情況。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種短單鏈蛋白編碼RNA分子,在轉錄后水平調控基因表達,抑制翻譯和/或促進mRNA降解[2]。miR-29b-3p是miR-29家族成員之一,已經表明是多種人類惡性腫瘤的預后因子[3]。叉頭框O(forkhead box O,FOXO)家族是一種廣泛表達的轉錄因子,已被證明在許多組織中調控發育過程和能量代謝以及腫瘤發生[4]。叉頭蛋白O3A(forkhead box O3A,FOXO3A)位于人類6q21染色體上,是FOXO亞家族成員,通過靶向效應基因的表達和活性,在調控多種細胞過程中發揮著重要作用,在人類結腸癌組織中FOXO3轉錄活性的喪失與腫瘤的生長有關[5]。miR-29b-3p和FOXO3A可能作為多種腫瘤的標志物,但兩者是否可共同參與結腸癌發展需要進一步明確。本研究通過檢測結腸癌組織中miR-29b-3p和FOXO3A的表達水平,旨在探討兩者表達與臨床病理參數的關系及在結腸癌患者預后中的作用,為探索結腸癌的診斷生物標志物和治療靶點提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取本院2015年1月至2017年1月期間收治的結腸癌患者82例作為研究對象,所有患者臨床資料完整且接受手術治療,術中收集患者結腸癌組織及距離腫瘤邊緣≥5cm的癌旁正常組織,保存于-80℃備用。82例患者中包括48例男性,34例女性;年齡42～75歲,平均(53.24±11.06)歲;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ期37例;組織分化程度:高、中分化54例,低分化28例;腫瘤直徑:≥5cm 42例,<5cm 40例;淋巴結轉移:有43例,無39例;腫瘤侵犯深度:黏膜35例,漿膜47例。所有患者經病理診斷證實為結腸癌,術前未接受其他任何治療,排除炎癥性腸病、其他惡性腫瘤及含自身免疫疾病者。本研究經醫院倫理委員會同意,所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR):各組稱取50mg組織樣品,根據Trizol試劑盒(貨號:CD-13433-ML,武漢純度生物科技有限公司提供)的說明書,使用Trizol法從各組樣品中提取總RNA。使用NanoDrop ND-12000分光光度計(美國Thermo公司提供)評估總RNA濃度和純度。逆轉錄反應使用Prime ScriptTM RT Master Mix(貨號:RRO47AA,日本Takara公司提供)進行。使用SYBR Green Master Mix試劑盒(貨號:Code NO.RR420L,日本Takara公司提供)在ABI7500檢測系統(美國應用生物系統公司提供)進行qRT-PCR。qRT-PCR反應體系和反應條件參考SYBR Green Master Mix試劑盒說明書。miR-29b-3p和FOXO3A mRNA引物,及U6和β肌動蛋白(β-actin)內參引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法量化相對表達,每組實驗設置3個復孔,重復3次。

表1 引物序列

1.2.2免疫印跡試驗(Western blot):稱取100mg各組組織,用裂解液裂解從組織中提取的蛋白質,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0009,碧云天生物技術提供)測定每個蛋白樣品的蛋白濃度進行定量;在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠上分離每組樣品等量的蛋白質(40μg),將蛋白質轉移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上,脫脂牛奶室溫封閉60min;一抗使用FOXO3A小鼠單抗體、β-actin小鼠單抗體(貨號:AF609,貨號:AF5001,碧云天生物技術提供),按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋抗體,參照說明書的步驟進行孵育;二抗選擇辣根過氧化物山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號:A0216,碧云天生物技術提供),參考二抗的說明書進行孵育;使用BeyoECL Plus試劑(貨號:P0018S,碧云天生物技術提供)檢測蛋白質條帶,檢測方法參考試劑盒說明書。

1.2.3隨訪:對結腸癌患者進行術后定期檢查隨訪,隨訪時間60個月(截止至2022年1月),每5個月統計一次,隨訪方式為門診復查、電話或短信,隨訪結束后統計總生存率。

2 結 果

2.1各組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA及蛋白表達水平的比較:結腸癌組織中miR-29b-3p表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.05),FOXO3A mRNA及蛋白表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組織中FOXO3A蛋白表達水平比較

表2 各組織中miR-29b-3p FOXO3A mRNA及蛋白表達水平的比較

2.2結腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達與患者臨床病理參數的關系:根據結腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達水平的平均值(1.55、0.48)分別將患者分為miR-29b-3p高表達組(n=40)和低表達組(n=42),FOXO3A mRNA高表達組(n=44)和低表達組(n=38)。結腸癌組織中miR-29b-3p和FOXO3A mRNA的表達均與患者的TNM分期和淋巴結轉移相關(P<0.05),而與性別、年齡、組織分化程度、腫瘤直徑大小和腫瘤侵犯深度無關(P>0.05),見表3。

表3 結腸癌組織中miR-29b-3p FOXO3A mRNA表達與患者臨床病理參數的關系n(%)

2.3結腸癌組織中miR-29b-3p與FOXO3A mRNA表達水平的相關性分析:結腸癌組織中miR-29b-3p與FOXO3A mRNA的表達水平呈負相關(r=-0.479,P<0.05),見圖2。

圖2 miR-29b-3p與FOXO3A mRNA表達水平的相關性分析

2.4結腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達與患者生存率的關系:本研究隨訪結果顯示,82例結腸癌患者中生存57例(總生存率為69.51%),死亡25例。Kaplan-Meier生存曲線顯示,miR-29b-3p低表達組患者5年總生存率為83.33%(35/42),明顯高于高表達組患者的5年總生存率55.00%(22/40)(χ2=6.820,P=0.009);FOXO3A mRNA高表達組患者的5年總生存率為88.64%(39/44),明顯高于低表達組患者的5年總生存率47.37%(18/38)(χ2=16.005,P<0.05)。見圖3。

圖3 生存曲線分析

2.5影響結腸癌患者5年死亡的因素分析:TNM Ⅲ期、miR-29b-3p高表達及FOXO3A mRNA低表達是影響結腸癌患者5年死亡的危險因素(P<0.05),見表4。

表4 影響結腸癌患者5年死亡的因素分析

3 討 論

結腸癌是世界范圍內的死亡率較高的惡性腫瘤,其發病機制復雜,臨床治療困難。近年來,隨著臨床研究的深入發展,多種基因及其相關蛋白在惡性腫瘤增殖、侵襲、轉移及凋亡中具有關鍵作用已成為共識。miR-29b-3p、FOXO3A及其相關蛋白異常表達與結腸癌發生、發展關系密切,研究導致其異常表達的原因至關重要。

miRNA不編碼蛋白質,但在癌癥的發展和治療中很重要,研究發現miRNA在結腸癌中異常表達[6]。最近的相關研究報道miR-29b家族在預防癌癥的發生和發展方面發揮了多種功能,如誘導細胞凋亡、調節細胞周期等[7]。miR-29b-3p作為miR-29家族成員之一,在多種類型癌癥中發揮調節因子的功能,在病理過程中具有重要作用。Li等[8]研究發現,結腸癌細胞中miR-29b-3p表達水平顯著升高,miR-29b-3p在腫瘤增殖、侵襲過程中發揮一定作用。據報道,FOXO家族控制多種細胞功能,其表達失調在代謝紊亂、衰老和腫瘤抑制中發揮著重要作用。FOXO3A是FOXO家族中最重要的成員,其定位于細胞核,直接或間接調控基因表達,其表達失調已被證實與多種類型癌癥的預后不良和惡性腫瘤嚴重程度有關。本研究中qRT-PCR結果顯示,miR-29b-3p在結腸癌組織中與癌旁正常組織相比表現為表達上調,FOXO3A mRNA在結腸癌組織中與癌旁正常組織相比表現為表達下調,另外Western blot結果顯示FOXO3A蛋白也呈現為低表達,與mRNA的表達趨勢一致,說明兩者異常表達可能參與結腸癌的發病過程。陳發帥等[9]研究結果也表明FOXO3A在胃癌組織中表達降低,發揮抑癌作用,并且與腫瘤的分化程度有關,可能發揮腫瘤抑制因子的功能。此外,有研究表明FOXO3A的低表達與結直腸癌的發生和轉移密切相關[10]。本研究進一步分析結果顯示,miR-29b-3p和FOXO3A mRNA的表達與結腸癌TNM分期和淋巴結轉移相關,與上述研究結果相似,該結果提示miR-29b-3p的高表達和FOXO3A mRNA的低表達可能與結腸癌轉移性存在關聯。

FOXO3A mRNA的3'-UTR含有多個miRNA靶向互補序列,許多miRNA在各種病理條件下可調節FOXO3A的表達,本研究初步分析了miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達在結腸癌組織中的相關性,發現miR-29b-3p與FOXOA3 mRNA的表達呈負相關,與該報道一致。且在最近的一項研究中提到,miRNA與其靶基因可存在相互作用,如FOXO3A可直接誘導miR-29b、miR-338表達,在乳腺癌轉移中發揮重要作用[11]。因此,我們推測FOXO3A可能誘導miR-29b-3p表達參與結腸癌的進展。此外,為進一步明確miR-29b-3p、FOXO3A與結腸癌患者預后的關系,本研究通過對結腸癌患者進行隨訪統計,采用Kaplan-Meier生存曲線分析,結果顯示,miR-29b-3p低表達組患者及FOXO3A mRNA高表達組患者具有更高的5年總生存率;同時進行了危險因素分析,結果發現TNM Ⅲ期、miR-29b-3p高表達及FOXO3A mRNA低表達是影響結腸癌患者5年死亡的危險因素。說明miR-29b-3p、FOXO3A可能具有評估預后情況標志物的潛力。綜上所述,miR-29b-3p在結腸癌組織中表達升高,FOXO3A mRNA及蛋白在結腸癌組織中表達降低,且miR-29b-3p、FOXO3A mRNA均與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移及不良預后相關,可以作為結腸癌患者預后評估的生物標志物。但miR-29b-3p與FOXO3A具體以哪種形式在結腸癌中發揮作用,尚需增加體內及體外實驗進行證實。