結直腸癌組織LGR5 Her-2 Ki-67與臨床病理參數及預后的關系

何耀海

(廣西省防城港市第一人民醫院病理科, 廣西 防城港 538021)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)即大腸癌,包括結腸癌與直腸癌,全球范圍內,結直腸癌是第三位最常見的惡性腫瘤,也是第二位最常見的惡性腫瘤死亡原因,而隨著居民飲食習慣改變,我國結直腸癌發病率也逐年升高[1]。結直腸癌根治術為治療CRC主要方式,但術后存在復發轉移情況使得患者總體預后仍不能令人滿意。富含亮氨酸重復單位的G蛋白耦聯受體5(Leucine-rich G-protein-coupled receptor 5,LGR5)系一種糖蛋白激素受體,與多種惡性腫瘤的發生、發展關系密切[2]。人表皮生長因子受體2(Human epidermogenic factor receptor 2,Her-2)是一種表皮生長因子,在多種惡性腫瘤中均有表達,可促進腫瘤細胞轉移、侵襲[3]。Ki-67為常用細胞增殖抗原,同時也為腫瘤標志物之一。本研究擬通過分析LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達,觀察其和臨床病理參數的關系,并探討三者對患者預后的預測價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2020年1月至2021年7月防城港市第一人民醫院收治的132例結直腸癌患者臨床資料。男75例,女57例,年齡為45～76歲,平均(60.50±5.70)歲。納入標準:①符合文獻[4]中關于原發性CRC的診斷標準,且經術后病理檢查確診為腺癌;②術前未接受放、化療治療;③均行結直腸癌根治術。排除標準:①合并除CRC外的其他惡性腫瘤;②合并嚴重肝腎功能障礙;③合并自身免疫病;④合并嚴重感染性疾病;⑤臨床資料不完整。

1.2方 法

1.2.1臨床病理參數收集:收集性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移情況等臨床病理參數。

1.2.2標本采集:患者入院后均接受結直腸癌根治術治療,術后留存新鮮(離體30min內)癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm)標本,置于EP管內,液氮冷凍并于-80℃下冷藏待測。

1.2.3主要試劑:鼠抗人LGR5單克隆抗體、鼠抗人Her-2單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑等均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.2.4免疫組織化學檢測:采用免疫組化SP法檢測LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達水平。①取組織石蠟包塊,常規切片(LGR5為3μm,Her-2為4μm,Ki-67為5μm)、脫蠟處理;②高壓修復抗原;③阻斷滅活內源性過氧化物酶;④滴加羊血清封閉;⑤滴加采用PBS稀釋(LGR5稀釋比為1∶300,Her-2稀釋比為1∶100,Ki-67稀釋比為1∶400)鼠抗人一抗,PBS沖洗;⑥滴加經辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗;⑦滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶(SP);⑧DAB顯色;⑨蘇木素復染;⑩脫水、透明、封片、鏡檢。設置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5結果判讀:結果由2位資深病理醫師雙盲法單獨閱片,于高倍鏡下(×400倍)隨機挑選5個視野,每個視野選取100個細胞。LGR5在細胞漿和細胞膜中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達,Her-2在胞膜中呈棕黃色顆粒即視為陽性表達,Ki-67在細胞核中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達。LGR5采用染色強度與陽性細胞占比乘積進行半定量分析:染色強度:無染色計0分,淺黃色計1分、黃色計2分,棕黃色計3分;陽性細胞占比:≤5%計0分,6%～25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分,乘積得分0～4分為陰性表達,5～12分為陽性表達。Her-2參考文獻[5]標準判定:無染色或<10%細胞膜染色為陰性(-),>10%細胞膜不完整染色為(+),>10%細胞膜完整較弱染色為(++),>30%細胞膜完整較強染色為(+++),(-)納入陰性表達組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達組。Ki-67采用陽性細胞占比進行半定量分析:≤10%為(-),11%～25%為(+),26%～50%為(++),>50%為(+++),(-)納入陰性表達組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達組。

1.3隨訪及預后分組:術后隨訪12個月(電話或回院復查形式隨訪),獲悉患者預后,并根據預后情況分為預后良好組(114例)、預后不良組(18例)。預后良好:截止至隨訪結束生存,且未復發轉移;預后不良:截止至隨訪結束任何原因所致死亡,或出現復發轉移。

1.4統計學方法:數據采用SPSS22.0軟件處理。計數資料以n(%)表示,行χ2/Fisher確切概率分析法檢驗;采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估預測價值,曲線下面積(AUC)0.7～0.9時有一定準確性,AUC>0.9時準確性較高。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LGR5、Her-2、Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達情況比較:CRC組織中LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

表1 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達情況比較n(%)

2.2LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達與CRC患者臨床病理參數關系:LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達與CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度等無關(P>0.05)。LGR5、Ki-67蛋白表達與浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移有關(P<0.05);Her-2蛋白表達與浸潤程度無關(P>0.05),而與TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白表達與CRC患者臨床病理參數關系n(%)

2.3不同預后患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達情況比較:預后不良組患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達率均高于預后良好組患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后患者LGR5 Her-2 Ki-67蛋白陽性表達情況比較n(%)

2.4LGR5、Her-2、Ki-67蛋白對CRC患者預后的預測價值分析:以CRC患者預后為因變量(1=預后良好組,2=預后不良組),將LGR5、Her-2、Ki-67蛋白(1=陽性,2=陰性)納入Logistic回歸分析模型,結果見表4。可見LGR5、Her-2蛋白陽性表達是預測CRC患者預后的獨立預測因子(P<0.05)。Ki-67蛋白不是預測CRC患者預后的獨立預測因子(P>0.05)。經計算可得,LGR5蛋白陽性表達預測CRC患者預后敏感度、特異度分別為66.7%、43.0%,Her-2蛋白為72.2%、72.8%。通過公式兩項聯合的預測指數=LGR5蛋白+(1.869/2.523)*Her-2蛋白繪制ROC曲線。結果顯示,兩項聯合預測AUC為0.804(0.709～0.899),敏感度、特異度為94.4%、82.5%,均高于LGR5、Her-2蛋白單項檢測,表明兩項聯合檢測的預測價值較高。見圖1。

圖1 兩項聯合預測CRC患者預后的ROC曲線

3 討 論

CRC為高度生物學異質性惡性腫瘤之一,術后復發轉移率較高。探尋新型分子標志物對CRC診斷、病情評估、治療方法選擇以及預測預后意義重大。本研究通過免疫組化法檢測LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達水平與臨床病理參數及預后的關系,探討其是否可作為CRC病情評估及預后的新型分子標志物。

LGR5為一種胃腸道腫瘤標志物,有研究指出,LGR5陽性細胞具備極強的自我增殖、分化、更新能力,在CRC發生發展中扮演關鍵角色。陳懇等[6]研究顯示,LGR5在人CRC癌前病變中表達異常升高,推測CRC可能由LGR5陽性細胞發展而來。本研究結果顯示,CRC組織中LGR5蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數關系發現,LGR5蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關,但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關,說明LGR5蛋白可能在CRC腫瘤細胞發生、發展、侵襲、轉移等一系列過程中扮演關鍵角色。分析原因為:LGR5蛋白通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進CRC發生發展,還可通過抑制Slug、N-cadherin等細胞黏附分子表達,促進上皮間質細胞轉化,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉移能力。

Her-2系迄今為止研究最多的乳腺癌相關基因,其過表達不但和腫瘤發生、發展有關,而且還是一個重要的臨床治療監測及預后指標[7]。國內外關于Her-2蛋白在CRC組織中表達情況報道差異較大,其陽性表達率為1.6%～81.9%不等[8-9]。本研究結果顯示,CRC組織中Her-2蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數關系發現,Her-2蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度無關,但和TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移有關,說明Her-2蛋白可能參與了CRC腫瘤細胞的發生、發展、侵襲、轉移過程。考慮原因為:Her-2蛋白可通過促進腫瘤組織形成新生血管及抑制腫瘤細胞凋亡,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉移能力。

Ki-67為一種目前廣泛使用的細胞增殖抗原,已有研究表明,其表達水平和腫瘤細胞生物學特性及患者預后有關[10]。本研究結果顯示,CRC組織中Ki-67蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數關系發現,Ki-67蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關,但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移有關,說明Ki-67蛋白可能參與了CRC腫瘤細胞的發生、發展、侵襲、轉移過程。究其原因為:Ki-67蛋白可通過減弱同質性細胞間的黏附力以及重塑細胞外基質來促進腫瘤組織新生血管形成,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉移能力。

此外,本研究結果顯示,LGR5、Her-2單獨檢測對CRC患者預后預測價值較低,而當兩項聯合檢測時,AUC、敏感度、特異度均明顯提高,表明兩項聯合檢測的預測價值較高。

綜上所述,LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中呈高表達,其表達水平和患者臨床病理參數密切相關,LGR5、Her-2兩項聯合檢測對患者預后具有較高預測價值。