“慢性應激—免疫微環境重塑”視角下的乳腺癌肝郁證治解讀

劉磊,李冰冰綜述 林家茂審校

2020年乳腺癌全球新發226萬,我國新發42萬,均居女性惡性腫瘤之首[1]。乳腺癌屬于中醫“乳巖”“乳石癰”等范疇,肝氣郁結貫穿乳腺癌發生發展的整個病程,肝郁是乳腺癌的病變基礎、核心病機[2-3]。近年來,現代醫學逐漸認識到慢性應激在乳腺癌發病、進展、轉移和治療中的重要性,“慢性應激—免疫微環境重塑”已成為近年腫瘤研究的熱點。本文試從“慢性應激—免疫微環境重塑”角度解讀乳腺癌病機、探索中醫疏肝方藥的作用機制,為乳腺癌的中西醫結合研究提供有益參考。

1 “慢性應激”導致肝郁引發乳腺癌

乳腺癌中醫肝郁病機與現代醫學“慢性應激”有關。慢性應激是由手術、環境和心理社會等一系列應激因素引起的機體長期過度的神經遞質及激素的釋放,主要包括下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)與交感神經系統(sympathetic nervous system,SNS)。慢性應激與惡性腫瘤發生、進展的關系近20年才逐漸被揭示。越來越多的證據表明,不良生活事件刺激、長期焦慮情緒等慢性應激顯著增加乳腺癌患病風險并促進疾病惡化。研究發現,“慢性應激”機體長期處于失穩狀態,會產生抑郁、不安和焦慮負面情緒等,增加腫瘤發生的風險[4]。流行病學和循證醫學數據表明慢性心理應激是乳腺癌發展和轉移的危險因素,長期處于慢性應激狀態的乳腺癌患者預后更差[5-6]。與血清腎上腺素水平低的乳腺癌患者相比,腎上腺素水平高的患者總生存率和無病生存率顯著降低;并且與鄰近的非癌組織相比,具有高水平激素的女性在活檢乳腺癌組織中也具有高水平的乳酸脫氫酶[7]。

“慢性應激”與肝郁有著本然一致性。中醫認為,肝主疏泄,調暢情志,情志病因的實質是不良生活事件所形成的心理應激,情志反應太過或不及,超越了人體生理、心理的適應與調節能力,就會損傷臟腑精氣,導致氣血失調,臨床上常將反復長期的精神刺激歸屬于“肝郁證”范疇[8]。應用慢性不可預見性應激方法模擬中醫肝氣郁滯動物模型已經得到學術界的廣泛認可[9]。情志失調與乳腺癌的發生發展甚至轉移,復發及生存期縮短存在密切關聯[10]?！皯n怒抑郁,昕夕積累”是乳腺癌重要病因,“肝郁”是乳腺癌發病的首要病機。慢性心理應激促進乳腺癌的發生發展,與中醫理論認為乳腺癌為“七情致傷之癥”不謀而合[11]。慢性應激可誘發腫瘤發生并促進腫瘤演進,特別是對機體的免疫功能和腫瘤微環境的重塑具有重要影響[12]。因此,慢性應激是抑郁、焦慮等情志因素與乳腺癌之間的一個重要中介因素,與乳腺癌的發病、預后密切相關,中醫乳腺癌肝氣郁滯的病機實質或與慢性應激引起的腫瘤微環境變化有關[13]。

2 “慢性應激—免疫微環境重塑”是乳腺癌發生、發展的重要機制

慢性應激可導致交感神經元和腎上腺髓質、皮質釋放兒茶酚胺、糖皮質激素,主要包括去甲腎上腺素、腎上腺素、皮質醇等。乳腺癌腫瘤免疫微環境(tumor immune microenvironment,TIME),是指浸潤到乳腺癌內部的免疫細胞及其所分泌的細胞因子與腫瘤細胞共同構成的局部內環境,是一個雙向、動態、錯綜復雜的相互作用網絡[14]。TIME與腫瘤免疫逃逸、血管生成、侵襲轉移及局部耐藥等顯著相關,對乳腺癌預后及療效影響巨大。腫瘤浸潤的免疫細胞主要包括巨噬細胞、髓源抑制性細胞、自然殺傷細胞( natural killer cell,NK細胞)、T細胞、B細胞及樹突細胞(dendritic cells, DCs)等。多項研究表明TIME中淋巴細胞及髓系細胞上均有應答應激相關激素的受體[15-16]。應激激素大量分泌可通過抑制機體免疫反應、重塑腫瘤免疫微環境,促進乳腺癌的發生、發展[17]。

2.1 慢性應激調節巨噬細胞重塑TIME 巨噬細胞通常極化為兩種類型:經典活化的M1型巨噬細胞和替代性活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞主要功能是激活Th1免疫應答,介導炎性反應及通過吞噬作用殺死腫瘤細胞[18];M2型巨噬細胞可產生IL-10、TGF-β等抗炎細胞因子抑制抗腫瘤免疫反應,分泌金屬蛋白酶誘導組織重塑,通過VEGF促進血管生成,促進上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),在腫瘤的血管重構、增殖、侵襲、免疫逃逸等方面起著重要的作用[19]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)與腫瘤患者預后呈負相關,在腫瘤生長過程中,TAMs被強制表露出M2型巨噬細胞的特點。研究證實,M1型和M2型巨噬細胞都具有高度的可塑性,維持巨噬細胞的M1樣表型及促進M2向M1轉化是改善TIME重塑的研究方向之一[20]。

抑郁癥狀與巨噬細胞浸潤到腫瘤微環境中呈正相關[21]。Bower等[22]通過全基因轉錄組法分析發現,社會孤立的早期乳腺癌的腫瘤標本中EMT和M2型巨噬細胞的基因表達上調,從而加速乳腺癌的侵襲和轉移。體外實驗表明[23],去甲腎上腺素及腎上腺素通過激活β2腎上腺素受體促進巨噬細胞向M2型轉化。Chen等[24]通過構建慢性應激誘導的乳腺癌肺轉移小鼠模型,發現β腎上腺素能信號持續激活可導致肺組織中巨噬細胞浸潤、并上調單核/巨噬細胞表達CCR2,從而促進乳腺癌細胞的肺定植轉移。Wu等[25]通過構建拘束應激/應激激素皮質酮負荷的小鼠荷瘤模型,發現皮質酮可通過調節LRP1/SIRPα的表達平衡抑制巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的作用,并證實miRNA-4695-3p可能是調控LRP1/ SIRPα表達的潛在靶點。

2.2 慢性應激增加骨髓來源抑制細胞重塑TIME 骨髓來源抑制細胞 (myeloid-derived suppressor cells, DSCs) 起源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞,主要分為粒細胞/多形核細胞MDSCs(PMN-MDSCs)和單核細胞MDSCs(M-MDSCs)兩大細胞亞群,在乳腺癌原發性和轉移灶中均大量存在[26]。MDSCs增殖的原因主要是腫瘤導致的 IL-1β、IL-6、TNF- α和S100蛋白等慢性炎性因子的大量釋放[27]。研究證實,DSCs 主要發揮免疫抑制功能,可以抑制由T細胞、B細胞和NK細胞介導的免疫應答,還能加強乳腺癌細胞侵襲與遷移能力、影響EMT、誘導轉移前微環境形成[24,28]。

慢性應激預暴露可導致荷瘤小鼠中MDSCs升高,促進乳腺癌轉移。MDSCs過繼轉移可顯著增加肺轉移灶。相反,用Gr-1抗體消耗內源性MDSCs可減輕肺轉移。慢性應激可使血清去甲腎上腺素濃度和骨髓酪氨酸羥化酶表達顯著升高。此外,β-腎上腺素能信號通路抑制劑普萘洛爾可抑制乳腺癌轉移,防止慢性應激誘導的MDSCs的擴張[29]。還有研究發現,小鼠慢性應激可上調IL-6和JAK/STAT3信號通路的表達,而通過普萘洛爾阻斷IL-6信號或抑制JAK/STAT3信號通路的激活可通過減少體內MDSCs的積累來減少腫瘤的生長和轉移。此外,普萘洛爾抑制異丙腎上腺素誘導的4T1細胞上清液中IL-6的表達,降低體外誘導的MDSCs比例[30]。

2.3 慢性應激作用腫瘤浸潤性T細胞重塑TIME 腫瘤浸潤性T細胞主要包括CD8+細胞毒性T淋巴細胞、CD4+輔助性T淋巴細胞,后者已經確定包括Th1、Th2、Th17和Tregs細胞4個細胞亞群,Th1/Th2和Th17 /Treg兩個穩態平衡在乳腺癌腫瘤免疫微環境中發揮關鍵作用[31]。目前研究顯示慢性應激對乳腺癌腫瘤浸潤性T細胞主要體現在CD8+細胞毒性T淋巴細胞、Th1/Th2失衡方面。

腫瘤免疫應答中,CD8+細胞毒性T淋巴細胞是抗腫瘤免疫的關鍵效應細胞;研究證實,存在CD8+T細胞浸潤的乳腺癌術后患者無病生存時間(DFS)及總生存時間(OS)更長[21]。慢性應激促進皮質醇分泌,血清高皮質醇水平與乳腺癌術后患者復發風險成正相關[32]。皮質醇與糖皮質激素受體(GR) 結合發揮免疫抑制作用,Gandhi等[33]使用單細胞測序數據集來分析免疫細胞和腫瘤細胞之間的GR表達差異,結果顯示免疫細胞上GR的表達高于腫瘤細胞和基質細胞,GR與 CD8+T細胞絕對分數呈正相關,GR的表達與B細胞、樹突狀細胞、CD4+T細胞和中性粒細胞之間的相關性較弱,高GR患者中T細胞衰竭基因PD-1、PD-L1、CTLA-4等表達亦顯著升高。

CD4+輔助性T淋巴細胞中Th1亞群可活化、促進CD8+T細胞及NK細胞免疫效應;Th2亞群主要促進B細胞成熟,活化體液免疫應答[32]。研究顯示,乳腺癌腫瘤組織中Th1/Th2比值小者預后更差,主要原因是Th1浸潤少于Th2浸潤,細胞免疫受抑制所致[35]。研究顯示,心理應激可選擇性抑制Th1細胞,促進Th1向Th2漂移,造成Th1和Th2細胞因子失衡,從而抑制細胞毒性T細胞介導的細胞免疫,削弱免疫監視,促進乳腺癌多的發生、發展[36]。還有研究發現,皮質醇能抑制Th1細胞介導的細胞免疫反應的釋放,導致機體腫瘤防御破壞[37]。

2.4 慢性應激抑制NK細胞免疫監視重塑TIME NK細胞來源于骨髓淋巴樣干細胞,其分化、發育依賴于骨髓及胸腺微環境,主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結。NK細胞能非特異性殺傷腫瘤細胞,在腫瘤微環境中具有免疫監視的作用。

研究發現抑郁與NK細胞功能之間存在強烈的負相關性,患有嚴重心理應激的乳腺癌患者的NK細胞毒性減低,導致乳腺腫瘤細胞免疫逃逸,具體機制與殺傷免疫球蛋白樣受體CD158b的表達改變有關[38]。慢性應激狀態下NK細胞對腫瘤的免疫監視作用可被糖皮質激素減弱,進而引發乳腺癌[39]。乳腺癌患者中,高水平的壓力與通過IFN-γ 刺激的低NK細胞毒性和低NK細胞反應相關,在乳腺癌應激動物模型的血樣中也觀察到類似的NK細胞毒性功能受損[40]。此外,慢性應激介導的血清素、多巴胺、兒茶酚胺等的改變均可抑制NK活性,從而影響機體正常保護性免疫[41]。

2.5 慢性應激影響B細胞重塑TIME 以往對惡性腫瘤相關的免疫性因子的探尋多集中在T細胞研究上,但近些年的研究提示B細胞對惡性腫瘤的預后、療效也至關重要。B細胞起源于骨髓,然后遷移至脾臟、淋巴結等次級淋巴結構,與抗原相互作用并產生抗原特異性抗體。

研究顯示,B細胞產生特異性抗體的能力可能會受到慢性應激誘導的Th1/Th2失衡的影響,且精神壓力刺激也會影響B細胞的再分配及其存活[14]。與CD20+B細胞浸潤程度較低的三陰性乳腺癌患者相比,CD20+B細胞在浸潤程度較高的患者中腫瘤核心、邊緣及間質均分布較多,且預后較好[42]。乳腺癌患者兒童時期不良事件經歷與腫瘤B細胞浸潤增加顯著相關[21]。

2.6 慢性應激抑制樹突狀細胞重塑TIME 樹突狀細胞(DCs)是功能最強的專職抗原呈遞細胞,DCs能夠特異性刺激B/T細胞成熟,激活適應性免疫應答,是啟動與維持對惡性腫瘤細胞免疫反應的基礎[43]。DCs 分為未成熟態和成熟態,未成熟DCs主要發揮免疫監視功能,具有極強的抗原吞噬能力。成熟DCs功能完善,表達高水平的共刺激因子和粘附因子,經由MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ類途徑將腫瘤抗原轉運至引流淋巴結內,激活細胞毒性 T 淋巴細胞。另外,DCs能促進Th細胞、NK細胞活化,產生抗腫瘤免疫反應[44]。

研究發現,慢性應激可通過阻礙DCs成熟抑制Th1細胞和CD8+T細胞。慢性應激促進糖皮質激素升高,誘導免疫抑制轉錄調節因子TSC22D3表達,從而抑制DCs活性[45]。糖皮質激素抑制DCs活化和遷移,促進DCs凋亡,并誘導耐受性DCs表型的產生;耐受性DCs主要通過抑制效應T細胞及誘導Tregs發揮免疫耐受作用。還有研究表明慢性應激通過β2-腎上腺素能受體調節IL-10和IL-13產生抑制DCs遷移[46]。

3 疏肝解郁方藥調節“慢性應激—免疫微環境重塑”改善乳腺癌預后

乳腺癌的發生、發展是一個復雜的生物學過程,肝郁是其基本病機,疏肝解郁是其對應的基本法則[47]。中醫治療乳腺癌方劑整體以疏肝解郁為主,臨床常用的疏肝解郁經典方劑主要有四逆散、柴胡疏肝散、逍遙散等,疏肝方藥對抗乳腺癌慢性應激療效確切。研究發現[48],慢性心理應激顯著促進了小鼠乳腺癌生長轉移,四逆散不僅可以減輕小鼠的抑郁樣行為,而且還能抑制慢性心理應激誘導的乳腺腫瘤生長和肺轉移,顯著降低乳腺癌細胞有氧糖酵解蛋白c-Myc、LDHA、PDK1的表達。另一項研究也表明[49],四逆散可以顯著抑制慢性心理應激誘導的小鼠乳腺癌異種移植瘤生長和轉移,熒光素酶報告基因分析篩選出柚皮素是四逆散中觸發肝細胞雌激素硫轉移酶活性的最具生物活性的化合物。慢性束縛應激法復制的肝郁證模型大鼠的乳腺出現增生樣變且伴有癌前相關因子的異常表達,柴胡疏肝散對模型大鼠肝郁證相關指標有較好的改善作用,還可緩減其乳腺增生及調節促癌/抑癌因子的表達[50]。慢性應激損傷能刺激大鼠血清腫瘤標志物升高,有直接誘發腫瘤發生的可能性。逍遙散能夠有效降低慢性應激誘發的腫瘤標志物升高,有望預防慢性應激誘發的癌變[51]。

疏肝理氣法在腫瘤免疫編輯重塑過程中也起著重要作用,疏肝解郁方藥可通過調節T細胞相關細胞因子以調整免疫功能,從而發揮免疫監視;還能夠激活單核巨噬細胞及NK細胞活性,調節MDSC[52]。游紫萱等[53]研究發現逍遙蔞貝散可調節乳腺癌根治術后輔助化療患者的血液T淋巴細胞亞群水平以增強免疫功能,抑制術后引流液IL-8、TNF-α含量,以減輕炎性反應,利于患者康復。常彥祥等[54]研究發現疏肝解郁之要藥柴胡的有效成分柴胡皂苷D可調節大鼠外周血T淋巴細胞亞群水平,提高細胞免疫功能,有助于改善機體抗腫瘤能力。杜家豪等[55]研究發現小柴胡湯可通過促進淋巴細胞的轉化,誘發細胞進一步分泌干擾素,提高CD3+、CD4+、IgG、IgA、IgM水平,抑制CD8+表達,提高機體細胞免疫及體液免疫的能力,發揮抗癌效應。Lu等[56]通過接種乳腺癌細胞誘導乳腺癌模型,慢性應激刺激誘導抑郁模型,兩者結合建立抑郁癌模型,探討疏肝健脾方預防乳腺癌發展的機制。結果表明抑郁障礙和腫瘤生長可不同程度地抑制小鼠的免疫功能,疏肝健脾方可通過降低CD8+調節免疫微環境T淋巴細胞凋亡和腫瘤細胞活性,增強免疫監視能力,抑制MDSC增殖,從而延長乳腺癌荷瘤小鼠的生存時間。

綜上,疏肝解郁方藥可通過干預“慢性應激—免疫微環境重塑”改善乳腺癌預后,其具體作用機制將是中西醫結合研究乳腺癌的重要內容。