二代測序技術(shù)檢測高血壓性腦出血合并顱內(nèi)感染患者腦脊液病原菌動態(tài)變遷情況

楊 景, 張 偉, 方 宜, 李中柱, 王詠雪

岳陽市中心醫(yī)院1.感染性疾病科;2.骨科;3.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,湖南 岳陽 414000

開顱手術(shù)是臨床治療高血壓性腦出血(hypertensive cerebral hemorrhage,HICH)的重要手段,術(shù)后顱內(nèi)感染是其常見并發(fā)癥之一,發(fā)生率約為0.3%～1.5%[1-2]。腦脊液標(biāo)本的病原菌培養(yǎng)和耐藥分析對臨床制定合理抗菌藥物使用方案具有重要指導(dǎo)意義,但仍存在培養(yǎng)時間長、假陰性率高、無法定量、無法檢測胞內(nèi)菌、寄養(yǎng)菌等顯著缺點[3-4]。二代測序技術(shù)是一種無需培養(yǎng)病原體的新型檢測方法,可直接提取DNA/RNA后進(jìn)行病原測序,并經(jīng)由生物信息學(xué)分析后獲取相關(guān)定量數(shù)據(jù),如病原體覆蓋度、序列數(shù)等,可快速識別病原微生物,具有準(zhǔn)確、快速、全面及無偏性識別多種病原體等顯著優(yōu)勢[5]。本研究基于二代測序技術(shù)對HICH合并顱內(nèi)感染患者的腦脊液病原菌分布情況進(jìn)行分析,旨在為臨床制定合理的抗菌藥物治療方案提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019年3月至2022年12月岳陽市中心醫(yī)院收治的513例HICH患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《高血壓性腦出血中國多學(xué)科診治指南》[6]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn);具有手術(shù)指征,接受開顱手術(shù);病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前合并免疫缺陷疾病或感染性疾病者;合并惡性腫瘤者;伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙者;存在手術(shù)用藥物過敏史者。根據(jù)顱內(nèi)感染嚴(yán)重程度將82例HICH合并顱內(nèi)感染患者分為輕度感染組(n=28)、中度感染組(n=36)與重度感染組(n=18)。輕度感染組:男性15例,女性13例;年齡46～69歲,平均年齡(54.32±6.43)歲。中度感染組:男性19例,女性17例;年齡46～69歲,平均年齡(55.65±5.64)歲。重度感染組:男性9例,女性9例;年齡43～70歲,平均年齡(56.69±4.65)歲。3組患者一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集與檢測 應(yīng)用無菌技術(shù)采集患者2～5 ml腦脊液。采用二代測序技術(shù)進(jìn)行檢測,具體如下。取3 ml腦脊液樣本,離心處理后提取DNA。應(yīng)用gilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段大小,通過Qubit dsDNA HS Assay Kit對DNA文庫濃度進(jìn)行質(zhì)控,經(jīng)滾環(huán)復(fù)制后生呈DNA納米球。將制備完成的DNB納米球加載至測序芯片,通過BGISEQ-50/MGISEQ-2000進(jìn)行測序。通過Burrows-Wheeler Aligner軟件比對去除高質(zhì)量數(shù)據(jù)中人參考基因組序列數(shù)據(jù),再將剩余數(shù)據(jù)中的低復(fù)雜度reads去除,而后與真菌、專用細(xì)菌、病毒、寄生蟲4個微生物大數(shù)據(jù)庫進(jìn)程比對,獲取可匹配的病原體序列,判斷可能的病原體。

1.2.2 耐藥性檢測 對82例HICH合并顱內(nèi)感染患者的腦脊液樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)與藥敏試驗。采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行檢測,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性因子的檢測 采集所有患者空腹肘靜脈血2 ml,經(jīng)離心取清液。采用酶聯(lián)免疫法檢測血管緊張素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)及降鈣素原(procalcitonin,PCT),試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技公司。

2 結(jié)果

2.1 HICH患者腦脊液分離情況統(tǒng)計 513例HICH患者腦脊液標(biāo)本中,共分離出3 391株病原菌。其中,2 385株(70.33%)為革蘭陽性菌,1 006株(29.67%)為革蘭陰性菌。見表1。

表1 HICH患者腦脊液分離情況統(tǒng)計/例(百分率/%)

2.2 HICH合并顱內(nèi)感染患者腦脊液中主要革蘭陽性菌耐藥特點 82例HICH合并顱內(nèi)感染患者的腦脊液樣本中,共分離出致病菌126株。其中,革蘭陽性菌檢出72株,檢出率為57.14%(72/126),以凝固酶陰性葡萄球菌34株(47.22%)、金黃色葡萄球菌24株(33.33%)和糞腸球菌14株(19.44%)為主。凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌對青霉素的耐藥性均達(dá)到100.00%,但對萬古霉素均無耐藥性。見表2。

表2 HICH合并顱內(nèi)感染患者腦脊液中主要革蘭陽性菌耐藥特點/例(百分率/%)

2.3 HICH合并顱內(nèi)感染患者腦脊液中主要革蘭陰性菌耐藥特點 分離的126株致病菌中,革蘭陰性菌54株(42.86%),主要為銅綠假單胞菌25株(46.30%)、鮑曼不動桿菌15株(27.78%)和肺炎克雷伯菌14株(25.93%)。銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌對亞胺培南均無耐藥性。見表3。

表3 HICH合并顱內(nèi)感染患者腦脊液中主要革蘭陰性菌耐藥特點/例(百分率/%)

2.4 各組患者氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性因子水平比較 中度感染組、重度感染組患者M(jìn)DA、Ang-Ⅱ、PCT、CRP均高于輕度感染組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組患者氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性因子水平比較

3 討論

腦出血是一種自發(fā)性、非外傷性的常見腦血管疾病,約占卒中的10%～30%,主要由腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂所致[7-8]。手術(shù)是臨床治療腦出血的常用手段,療效顯著,但患者術(shù)后極易出現(xiàn)顱內(nèi)感染等并發(fā)癥,影響其術(shù)后康復(fù)效果。謝武表等[9]研究發(fā)現(xiàn),抗菌藥物治療可顯著降低感染發(fā)生率。目前,抗菌藥物治療仍是治療顱內(nèi)感染的重要措施,但經(jīng)驗性用藥容易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性,使得臨床治療難度顯著提升[10-11]。因此,針對致病菌的耐藥特點,選擇合適的抗生素,對改善患者病情至關(guān)重要[12-14]。

本研究結(jié)果顯示:513例HICH患者腦脊液標(biāo)本中,共分離出3 391株病原菌;2 385株(70.33%)為革蘭陽性菌,1 006株(29.67%)為革蘭陰性菌。這提示,病原菌感染在神經(jīng)外科患者中高發(fā),以革蘭陽性菌占主導(dǎo)地位。開顱術(shù)后顱內(nèi)感染具有高發(fā)性,需要采取有效的預(yù)防和治療措施[15-17]。本研究結(jié)果顯示:凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌對青霉素的耐藥性均達(dá)到100.00%,但對萬古霉素均無耐藥性;銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌對亞胺培南均無耐藥性。這提示,凝固酶陰性葡萄球菌已成為醫(yī)院感染最常見的病原菌之一,不同病原菌對機(jī)體耐藥機(jī)制存在差異性。高耐藥性菌株的存在凸顯了目前抗菌藥物耐藥性的嚴(yán)峻形式,需要更深入的研究和監(jiān)測來應(yīng)對這一挑戰(zhàn)[18-20]。在治療術(shù)后顱內(nèi)感染時,需要綜合考慮藥物的耐藥性和患者的具體情況,選擇合適的抗菌藥物。此外,中度感染組、重度感染組患者M(jìn)DA、Ang-Ⅱ、PCT、CRP均高于輕度感染組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,檢測HICH患者血清中的Ang-Ⅱ、PCT、MDA、CRP水平對診斷HICH術(shù)后顱內(nèi)感染具有一定的輔助價值,為臨床決策提供額外支持。

綜上所述,HICH合并顱內(nèi)感染病原菌種類較多,定期對病原菌構(gòu)成和藥敏情況進(jìn)行分析,并結(jié)合檢測血清Ang-Ⅱ、MDA、PCT、CRP水平,有利于為臨床早期抗感染治療、合理選擇抗生素提供理論依據(jù)。