洛神花總黃酮提取工藝及抗氧化性研究

韓鹿 黃曉楚 韓遠鳳 馬海寧 方桂嬌

摘 要：本研究通過超聲波輔助提取法以及水浴加熱法提取洛神花總黃酮，并檢測提取物的抗氧化性。采用單因素及正交試驗考察了料液比、乙醇濃度、水浴溫度、超聲時間對總黃酮提取量的影響，確定最佳提取方案為洛神花粉末與40%乙醇溶液的料液比1∶10（g∶mL）、超聲波提取70 min、80 ℃水浴加熱

30 min，所得總黃酮含量為32.36 mg·g-1，提取物對DPPH自由基具有較好的清除率。

關鍵詞：洛神花；黃酮；抗氧化性

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Flavonoids from Hibiscus sabdariffa

HAN Lu， HUANG Xiaochu， HAN Yuanfeng， MA Haining， FANG Guijiao

（Guangzhou College of Technology and Business， Foshan 528138， China）

Abstract： In this study， the total flavonoids of Hibiscus sabdariffa were extracted by ultrasonic-assisted extraction method as well as water bath heating method and the antioxidant properties of the extracts were tested. The effects of material-liquid ratio， ethanol concentration， water bath temperature， and ultrasonic time on the amount of total flavonoids extracted were investigated by using one-way and orthogonal tests， and the optimal extraction scheme was determined to be the material-liquid ratio of Hibiscus sabdariffa powder to 40% ethanol solution

1∶10 （g∶mL）， ultrasonic extraction for 70 min， and water bath heating at 80 ℃ for 30 min， and the obtained content of total flavonoids was 32.36 mg·g-1， and the extract had a good scavenging rate of DPPH radicals.

Keywords： Hibiscus sabdariffa; flavonoids; antioxidant activity

洛神花在我國福建、云南和廣東等地都有種植，其花萼中富含黃酮類化合物、維生素C、氨基酸、花青素等，具有抗癌、抗炎癥、降血糖、降血脂等功效[1]。洛神花所含有的天然色素提取物已作為無毒副作用的食品著色劑廣泛應用于食品加工領域[2]。常見的黃酮類化合物提取方法包括有機溶劑提取法、熱水浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超聲波微波協同萃取和水浴加熱法等[3-4]。有機溶劑常被用來提取胞內水溶性較差的活性成分，提取過程中的高溫在破壁的同時，可以提高目標提取物的溶解度[5]。微波及超聲波輔助提取法利用物理手段加速細胞壁破裂、內容物的釋放及溶劑與目標提取物的充分接觸來提高提取效率[5-6]。

本研究采用乙醇溶液進行黃酮類物質提取，并以超聲波破壁及水浴加熱的方式輔助提高提取效率，并驗證提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洛神花，大參林藥店；蘆丁標準品，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇，廣東光華科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海易恩化學試劑有限公司。所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

小型磨粉機，九陽股份有限公司；TD5臺式低速離心機，上海利鑫堅離心機電子有限公司；KS-600D型超聲波清洗機，寧波海曙科生超聲設備有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ES500-1B電子天平，沈陽亮衡天平儀器有限公司；V-1000型可見分光光度計，上海翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 洛神花提取工藝及黃酮含量的測定

洛神花粉碎過40目篩，取一定量的粉末并加入一定濃度的乙醇水溶液，常溫以600 W超聲一段時間，然后在一定溫度下浸提一段時間，在4 000 r·min-1條件下離心10 min，取上層澄清提取液。

以蘆丁為標準品測定黃酮含量，于510 nm波長處測量吸光度。總黃酮提取含量計算為

總黃酮提取量（mg·g-1）=C×N×V/M（1）

式中：C為洛神花總黃酮濃度，mg·mL-1；N為稀釋倍數；V為洛神花提取液體積，mL；M為洛神花粉末質量，g。

1.2.2 單因素試驗

固定料液比為1∶10（g∶mL），超聲功率為600 W，超聲時間為30 min，水浴溫度為60 ℃，水浴時間為30 min。通過單因素試驗分別考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25）、乙醇濃度（10%、20%、40%、60%和80%）、水浴溫度

（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）、超聲時間

（20 min、40 min、60 min、80 min和100 min）這4個因素對黃酮提取量的影響，以黃酮提取量為評價標準，篩選出每個因素的最佳水平。

1.2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果選取料液比、乙醇濃度、水浴溫度以及超聲時間4個因素，每個因素3個水平，以總黃酮提取量為指標進行L9（34）正交試驗。正交試驗因素水平見表1。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

將1 mL不同黃酮濃度（0.5 μg·mL-1、0.7 μg·mL-1、0.9 μg·mL-1、1.3 μg·mL-1和2.6 μg·mL-1）的洛神花黃酮提取液與6.0 mL濃度為0.1 mg·mL-1的DPPH乙醇混勻，避光反應30 min。于517 nm波長處測量吸光度，以無水乙醇作為參比溶液，進行背景組和對照組的測定。DPPH自由基清除率計算為

DPPH自由基清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100% ? ? ? （2）

式中：A0為1.0 mL無水乙醇+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（對照組）；A1為1.0 mL黃酮提取液+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（試驗組）；A2為1.0 mL黃酮提取液+6.0 mL無水乙醇的吸光值（背景組）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

通過配制蘆丁標準溶液得到510 nm處黃酮濃度C（mg·L-1）與吸光度A之間的回歸曲線公式為A=12.089C-0.013 4，R2=0.999 3，將測得的洛神花提取液吸光度代入此公式即可計算出洛神花中總黃酮濃度。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對洛神花總黃酮提取量的影響

由圖1可知，洛神花提取液的料液比為1∶10（g∶mL）時提取出的總黃酮含量最高。在料液比較低的情況下，溶劑量太少使洛神花粉末與溶劑接觸不充分，過高的料液比會使黃酮受到胞內其他化合物競爭性溶出的影響，降低總黃酮提取量。因此，該條件下最優料液比為1∶10（g∶mL），選擇1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）進行正交試驗。

2.2.2 乙醇濃度對洛神花總黃酮提取量的影響

由圖2可知，在乙醇濃度為40%時，洛神花提取液中總黃酮含量最高，黃酮與乙醇的極性相近，在40%乙醇中的分配比最大。因此，選擇濃度為30%、40%、50%的乙醇進行正交試驗。

2.2.3 水浴溫度對洛神花總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在水浴溫度為70 ℃時，洛神花提取液中總黃酮含量達到最高值。在溫度較高的條件下，總黃酮極易發生氧化分解，從而影響總黃酮的提取量。因此，選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴溫度進行正交試驗。

2.2.4 超聲時間對洛神花總黃酮提取量的影響

由圖4可知，在超聲波處理時間為80 min時，洛神花提取液中總黃酮含量達到最高值，隨后逐漸降低。超聲波的機械振動和空化效應，可以破壞植物細胞的結構，從而讓溶劑更快地滲入細胞中，由此提高了細胞中物質的溶解速率，增加了黃酮得率。超聲波作用的時間較短時，破壁效果不充分總黃酮尚未全部溶出；隨著超聲波作用時間的延長，細胞內的類黃酮成分與乙醇溶液完全作用，使得更多的類黃酮成分溶解出來，從而提高了提取率；但超聲過程過久也會使其他非黃酮成分溶解，使總黃酮含量下降。因此，選擇超聲時間為70 min、80 min、90 min進行正交試驗。

2.3 正交試驗結果

由表2中R值可以得出，洛神花總黃酮提取量的影響因素主次順序是A＞C＞D＞B，即料液比＞水浴溫度＞超聲時間＞乙醇濃度。正交試驗中的最優工藝與由K值得到最佳工藝一致，最優工藝參數為A2B2C3D1，即料液比1∶10（g∶mL）、乙醇濃度40%、水浴溫度80 ℃、超聲時間70 min。此工藝下，洛神花總黃酮提取量為32.36 mg·g-1。

2.4 DPPH自由基清除率分析

由圖5可知，黃酮濃度為0.5 μg·mL-1時，洛神花提取液的DPPH自由基清除率為41.77%。黃酮濃度為2.6 μg·mL-1時，洛神花提取液的DPPH自由基清除率達到99.85%，洛神花提取液對DPPH自由基的清除作用十分明顯。

3 結論

本研究以洛神花總黃酮提取量為考察對象，對不同料液比、乙醇濃度和水浴溫度以及超聲波作用時間進行了單因素試驗，并通過正交試驗確定最佳提取工藝。結果表明，影響洛神花總黃酮提取量的因素主次順序為料液比＞水浴溫度＞超聲時間＞乙醇濃度，最佳提取工藝為洛神花粉末與40%乙醇溶液的料液比1∶10（g∶mL）、超聲波提取70 min、80 ℃水浴加熱30 min，使用此提取方法得到的總黃酮含量為32.36 mg·g-1。本研究將超聲波輔助提取法、乙醇溶液提取法與水浴加熱法3種方法結合起來提取洛神花總黃酮，工藝條件安全、穩定、經濟、環保，能夠有效提高總黃酮的提取量，為洛神花的提取工藝研究提供了理論依據。

參考文獻

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