基于網絡藥理學與分子對接技術探討三參通脈合劑治療冠心病的作用機制

張藎元,劉 巍,劉紅旭,田 偉,連妍潔,佟 彤

冠狀動脈性心臟病簡稱冠心病,指冠狀動脈發生粥樣硬化,引起管腔狹窄或閉塞,心肌缺血缺氧甚至壞死導致的心臟病,也稱為缺血性心臟病[1]。《中國心血管健康與疾病報告2021》指出,我國心血管病患病率持續上升,推算我國心血管病現患人數3.3億例,其中冠心病1 139萬例[2]。冠心病是全球范圍內導致死亡和過早死亡的主要原因[3],可見冠心病嚴重危害人類健康,是重大的公共衛生問題。中醫治療冠心病在提高臨床療效、改善疾病預后等方面有一定優勢,為治療冠心病增添了新活力。

首都醫科大學附屬北京中醫醫院名老中醫許心如結合30年臨床經驗,針對氣陰兩虛、瘀血內阻型冠心病組方二參通脈湯,后發展為三參通脈合劑口服液、三參通脈合劑,藥物組成包括太子參、玄參、丹參、延胡索、赤芍、白芍、細辛、柴胡、枳實、娑羅子等。有研究顯示,三參通脈合劑口服液治療輕中度冠心病臨床療效優于消心痛[4],可降低冠心病病人內皮素(ET)水平,促進降鈣素基因相關肽(CGRP)釋放,改善冠狀動脈血流[5],降低冠心病病人偏高的T細胞亞群比值(CD4+/CD8+),抑制免疫功能亢進,改善心肌缺血[6]。三參通脈合劑可降低血漿纖維蛋白原(FIB)水平,提高纖溶酶(PL)水平,改善血液高凝狀態[7],其與常規西藥聯用可進一步提高冠狀動脈成形術或(及)支架置入術后心絞痛再發作病人的臨床療效[8]。有實驗顯示,三參通脈合劑口服液可增加冠狀動脈流量,降低冠狀動脈阻力、外周阻力及心肌耗氧量,縮小心肌缺血家犬心肌梗死范圍,改善ST段異常[9]。目前針對三參通脈合劑治療冠心病的藥理學機制研究較少。中藥復方是中醫藥物治療疾病的主要載體,數千年的臨床實踐明確了中藥復方的有效性,因其具有多成分、多靶點、多途徑、系統調控等作用特點,較難進行系統的機制研究。網絡藥理學基于系統和整體水平,構建“疾病-表型-基因-藥物”多層次網絡以探討藥物與機體的相互作用,是適用于中藥復方機制探討的研究方法[10]。逆向分子對接可將小分子化合物與三維結構的相關靶點進行空間和能量匹配,從而評價預測藥物小分子與潛在作用靶點的結合活性,補充了網絡藥理學的預測結果,從分子水平闡釋了中藥治療疾病的作用機制[11]。本研究基于分子水平,通過網絡藥理學及分子對接技術,從化學成分、作用靶點、分子功能和信號通路等多方面系統探討三參通脈合劑治療冠心病的作用機制。研究流程圖見圖1。

圖1 三參通脈合劑治療冠心病作用機制的研究流程圖

1 資料與方法

1.1 三參通脈合劑潛在活性化合物及作用靶點篩選

應用高通量中醫藥實驗和參考指導數據庫HERB[12](http://herb.ac.cn)檢索三參通脈合劑核心藥物太子參、玄參、丹參、延胡索、赤芍、白芍、細辛、柴胡、枳實、娑羅子所含化學成分,根據化學成分的藥物動力學(absorption and distribution and metabolism and excretion,ADME)參數進行篩選。具體篩選過程及條件:首先根據HERB數據庫中口服生物利用度(oral bioavailability,OB)初步篩選得到OB≥30%的成分;其次利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)初篩得到化學成分的Canonical SMILES結構,將其導入SwissADME平臺[13](http://www.swissadme.ch/)進一步篩選。設置篩選標準[14]:藥代動力學(pharmacokinetics)為胃腸道吸收[15](gatrointestinal absorption),為“high”;類藥性(druglikeness)為5個相關參數(lipinski、ghose、veber、egan、muegge),≥2個參數為“high”,篩選后得到三參通脈合劑潛在活性化合物。

將篩選最終所得化合物的Canonical SMILES結構導入SwissTargetPrediction平臺[16](http://www.swisstargetprediction.ch/),物種選擇“Homo sapiens”,篩選可能性(probability)>10%的蛋白作用靶點,將Gene Symbol導入Excel中。

1.2 冠心病潛在作用靶點預測及篩選

以“coronary atherosclerotic heart disease”“coronary heart disease”“CHD”“ischemic heart disease”為檢索詞,檢索GeneCards數據庫[17](https://www.genecards.org/)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)數據庫[18](http://www.omim.org/)、DisGeNET數據庫[19](http://www.disgenet.org/)、DrugBank數據庫[20](http://www.drugbank.ca/)、TTD(Therapeutic Target Database)數據庫[21](http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)獲得冠心病的作用靶點。根據靶點與疾病相關性評分的中位數篩選各數據庫檢索結果,將5個數據庫篩選結果合并,刪除重復靶點,獲得冠心病的潛在致病靶點。采用UniProt數據庫[22](https://www.uniprot.org/)將所得疾病靶點規范為Gene Symbol。

1.3 三參通脈合劑治療冠心病的潛在靶點預測

將篩選得到的三參通脈合劑作用靶點與冠心病靶點導入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),取交集得到藥物與疾病的共同靶點,繪制韋恩圖。

1.4 構建“中藥-成分-靶點”網絡圖

利用軟件Cytoscape 3.9.1[23],根據韋恩圖中的共同靶點構建三參通脈合劑治療冠心病的“中藥-成分-靶點”網絡圖。圖中節點(node)表示三參通脈合劑中各味中藥、潛在活性化合物及作用靶點,邊(edge)表示中藥與成分、成分與靶點之間的關系。

1.5 構建靶點蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡

為闡明靶點蛋白之間的相互作用,將得到的共同靶點導入STRING 11.5數據庫[24](https://cn.string-db.org/),物種選擇“homo sapiens”,設置靶點關聯置信度為中等置信度0.4,其余參數設置為默認值,構建靶點的PPI網絡。

將PPI網絡導入軟件Cytoscape 3.9.1進行可視化處理,利用CytoNCA插件進行拓撲分析,以參數度值(Degree)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、緊密中心性(closeness centrality,CC)、局部邊連通性(local average connectivity-based method,LAC)進行篩選,篩選條件為每個參數均大于中位數值,篩選核心靶點。

1.6 基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

為尋找三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預測靶點顯著富集的主要功能注釋及信號通路,將獲得的藥物-疾病共同靶點導入Metascape數據庫[25](http://metascape.org),進行GO功能富集分析,包括分子功能(molecular functions,MF)、生物過程(biological process,BP)和細胞組分(cellular components,CC)3個方面及KEGG通路富集分析。設置物種為“H.sapiens”,Min Overlap為3,Pvalue cutoff為0.01,保存結果并繪圖。

1.7 分子對接評估

根據“中藥-成分-靶點”、PPI網絡及相關文獻篩選主要活性成分與關鍵靶點進行分子對接評估。通過RCSB PDB數據庫[26](https://www.rcsb.org/)獲得靶點蛋白三維晶體結構的pdb格式;通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得藥物小分子結構的sdf格式,并通過OpenBabel3.1.1[27](http://openbabel.org/wiki/Main_Page)轉化為pdb格式保存。使用AutoDock Tools 1.5.7[28](https://ccsb.scripps.edu/mgltools/)對靶點蛋白和藥物小分子進行pdb格式處理后保存為pdbqt格式:對靶點蛋白去水、加氫,并設置為受體;對藥物小分子加氫,設置為配體,檢測并選擇扭轉鍵。設置對接口袋后采用AutoDock Vina1.1.2[29](https://vina.scripps.edu/)進行分子對接,以對接評分結合能(affinity)評價配體與靶點的結合活性:對接結合能<-17.79 kJ/mol認為配體與靶點之間具有結合活性,結合能<-20.93 kJ/mol表明結合活性較佳,結合能<-29.30 kJ/mol說明兩者之間有強烈的對接活性[14,30]。通過PyMOL 2.3.0[31]繪制部分分子對接模型。

2 結 果

2.1 三參通脈合劑的潛在活性化合物及靶點篩選

初步篩選后共獲得437個三參通脈合劑主要活性成分,其中太子參14個,玄參16個,丹參68個,延胡索44個,赤芍29個,白芍38個,細辛75個,柴胡121個,枳實23個,娑羅子9個,合并后去除重復成分72個,最終篩選得到中藥復方三參通脈合劑潛在活性化合物365個,基本信息見表1。初步共獲得所有成分的預測靶點4 029個,其中太子參312個,玄參124個,丹參603個,延胡索564個,赤芍377個,白芍460個,細辛399個,柴胡542個,枳實503個,娑羅子145個,合并后去除重復靶點3 003個,最終獲得三參通脈合劑主要活性成分預測靶點1 026個。

表1 三參通脈合劑的潛在活性化合物

2.2 冠心病相關靶點獲取

檢索GeneCards數據庫得到9 393個疾病相關靶點,相關性得分(relevance score)最高值為131.24分,最低值為0.10分,以相關性得分≥17.93分為條件篩選得到1 175個靶點。檢索DisGeNET數據庫得到1577個疾病相關靶點,得分最高值為0.7,最低值為0.01,以得分≥0.02為條件篩選得到794個靶點。其余數據庫檢索結果分別為OMIM數據庫420個、DrugBank數據庫35個、TTD數據庫6個。合并后共2 430個靶點,刪除635個重復值,最終獲得1 795個疾病相關靶點。

2.3 三參通脈合劑治療冠心病潛在作用靶點預測

將篩選得到的1 026個三參通脈合劑作用靶點與1 795個冠心病靶點相映射,取交集得到320個潛在治療靶點,繪制韋恩圖。詳見圖2。

圖2 三參通脈合劑-冠心病靶點韋恩圖

2.4 “中藥-成分-靶點”網絡圖與主要活性成分分析

交集得到的320個靶點來源于10味中藥的212個潛在活性成分,將其導入Cytoscape 3.9.1系統,構建“中藥-成分-靶點”網絡圖見圖3。該網絡包含561個節點、3 314條邊。紫色圓形代表復方中的中藥;六邊形代表中藥的活性化合物;藍色菱形代表作用靶點。黃色為太子參、灰色為玄參、橙紅色為丹參、青色為延胡索、淡粉色為赤芍、紫色為白芍、粉紅色為細辛、淡黃色為柴胡、淡紫色為枳實、綠色為娑羅子、橙黃色為多種中藥共有。網絡中的成分為多種中藥共有,以19個命名為A-S的節點表示共有化合物成分的中藥組合,命名方式見表2。網絡節點度值表示通過該節點的邊的條數,認為度值越大表示該節點在網絡中越重要。網絡中有161個(76%)化合物與2個及以上靶點作用,化合物平均度值為15.38,中位數度值為8,度值居前10位的化合物見表3。度值較高的化合物可能在三參通脈合劑治療冠心病中發揮重要的作用。253個(79%)靶點與2個及以上化合物連接,即與其他蛋白有共同配體,靶點度值越高提示該靶點可能參與三參通脈合劑治療冠心病。

表2 “中藥-成分-靶點”網絡圖中A-S命名規則

表3 “中藥-成分-靶點”網絡中度值居前10位的化合物

圖3 三參通脈合劑-冠心病“中藥-成分-靶點”網絡圖

2.5 PPI網絡構建及核心基因篩選

將藥物-疾病共同靶點導入STRING 11.5數據庫得到PPI網絡,將PPI網絡導入軟件Cytoscape 3.9.1可視化,利用CytoNCA插件進行拓撲分析,以參數(度值、BC、CC、LAC)大于中位數為條件,篩選核心靶點。共篩選2次:初始320個節點、6 145條邊,第1次篩選(度值≥30、BC≥0.001、CC≥0.491、LAC≥14.08)后得到107個節點、2 517條邊;第2次篩選(度值≥62、BC≥0.004、CC≥0.536、LAC≥30.034)后得到34個節點、511條邊,篩選過程見圖4。得到的34個節點為核心基因:清蛋白(ALB)、蛋白激酶B(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素1B(IL1B)、Src酪氨酸激酶(SRC)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、胱天蛋白酶3(CASP3)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、90 kDa熱休克蛋白αA1(HSP90AA1)、低氧誘導因子-1A(HIF1A)、HRAS原癌基因(HRAS)、雌激素受體1(ESR1)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、白細胞介素8(CXCL8)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(CCND1)、趨化因子配體2(CCL2)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)、Toll樣受體4(TLR4)、絲裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)、Ras同源基因家族成員A(RHOA)、內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、去乙酰化酶Sirtuin-1(SIRT1)、C型蛋白酪氨酸磷酸酶受體(PTPRC)、激酶插入結構域受體(KDR)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、Janus激酶2(JAK2)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員1(SERPINE1)、E1A結合蛋白P300(EP300)、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1(PTPN1)。核心基因的PPI網絡見圖5。

圖4 核心靶點篩選過程及結果

圖5 核心基因的PPI網絡圖

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析結果顯示,三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預測靶點主要富集在2 753個BP、305個MF、186個CC中。顯著性較高的20個結果見圖6A～圖6C。三參通脈合劑治療冠心病涉及的BP包括蛋白質磷酸化的正調節(positive regulation of protein phosphorylation)、細胞遷移的正向調節(positive regulation of cell migration)、循環系統過程(circulatory system process)等;MF包括蛋白激酶活性(protein kinase activity)、內肽酶活性(endopeptidase activity)、激酶結合(kinase binding);CC包括膜筏(membrane raft)、受體復合物(receptor complex)、軸突(axon)等。

圖6 三參通脈合劑活性化合物預測靶點的GO和KEGG富集分析(A為GO-MF富集分析;B為GO-BP富集分析;C為GO-CC富集分析;D為KEGG富集分析)

KEGG富集分析結果顯示,三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預測靶點主要富集在226條通路,詳見圖6D。顯著性較高的20條通路包括癌癥途徑(pathways in cancer)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、Ca2+信號通路(calcium signaling pathway)、環磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)等。根據靶點的信號通路富集構建“靶點-通路”網絡見圖7,該網絡有229個節點、495條邊,其中節點包括209個基因靶點、20條信號通路。黃色圓形代表預測靶點,紅色箭頭代表富集的KEGG信號通路。三參通脈合劑治療冠心病涉及多靶點、多通路。

圖7 “靶點-通路”網絡圖

2.7 分子對接結果

根據“中藥-成分-靶點”網絡及相關文獻選擇三參通脈合劑治療冠心病潛在主要藥物成分,綜合考慮PPI網絡與“中藥-成分-靶點”網絡選擇可能的核心靶點基因。將11種主要藥物成分與5個核心靶點AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3進行分子對接。共得到55組受體-配體,55組對接最低結合能見圖8,55組對接結合能均<-20.93 kJ/mol,提示結合活性均較佳;其中39組(70.9%)對接結合能<-29.30 kJ/mol,提示有強烈的對接活性。以SRC-紫丹參素C(przewaquinone c,HBIN040997)組合對接結合能最低,為-41.02 kJ/mol,結合活性最佳;STAT3-去氫延胡索甲素(dehydrocorydaline,HBIN022998)對接結合能最高,為-24.70 kJ/mol,結合活性相對較差。55組受體-配體中有25組屬于“中藥-成分-靶點”網絡,平均對接結合能為-32.40 kJ/mol,提示網絡中藥物化合物與靶點間對接活性良好,預測方法合理。另有30組網外組合,平均對接結合能為-31.52 kJ/mol,對接活性良好,在今后研究中值得進一步挖掘與探討。部分受體-配體分子對接模型圖見圖9。靶點蛋白、蛋白質殘基、藥物小分子分別以3種不同顏色標記,黃色虛線為氫鍵。

圖8 三參通脈合劑預測潛在化合物成分與核心靶點分子對接結果

圖9 三參通脈合劑預測化合物-靶點分子對接部分模型圖

3 討 論

冠心病的病理基礎為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),AS累及冠狀動脈,冠狀動脈供血減少,與心肌需血之間發生矛盾,即冠狀動脈血流量無法滿足心肌代謝的需要,引起心肌缺血缺氧,進一步積聚乳酸等代謝產物刺激神經產生疼痛。既往研究顯示,AS的發生與脂質代謝異常、內皮細胞(EC)損傷、血小板功能異常、平滑肌細胞(SMC)增生等有關,炎癥反應促使斑塊不穩定或破裂,繼發嚴重持續的心肌缺血[1]。現代醫學藥物治療通過改善冠狀動脈血供,降低心肌耗氧,改善病人癥狀,同時阻止AS進展,預防心肌梗死,改善預后。

中醫學將冠心病歸屬于“胸痹”范疇,主要病機為心脈痹阻,瘀血為病理產物。本病臨床以老年人多見,表現為氣虛血瘀、氣陰兩虛等夾雜證候。許心如教授經多年臨床觀察,運用氣血辨證理論,創建益氣養陰、活血通脈的方法治療胸痹,以三參通脈合劑為代表方劑。方中太子參益氣養陰、丹參活血通脈為君藥;延胡索通脈止痛,赤白芍共用養血散瘀止痛,玄參滋陰散結,上四味為臣藥;佐娑羅子、細辛溫通止痛,助君藥通脈而制其苦寒;枳實、柴胡為使藥,加強行氣之功,助氣機條達,諸藥合用益氣滋陰、理氣活血、化瘀止痛。本方常用黃芪加強益氣之功;加酸棗仁、女貞子之品效養陰之用。臨床廣泛使用三參通脈合劑輔助治療冠心病。

3.1 三參通脈合劑治療冠心病的潛在有效成分分析

本研究“中藥-成分-靶點”網絡圖中,靶點數量排名居前5位的潛在有效成分為mono-O-methylwightin、柚皮素(naringenin)、izoteolin、紫丹參素C(przewaquinone C)、芹菜素三甲醚(5,7,4′-trimethylapigenin),來源于丹參、赤芍、枳實、延胡索4味藥物。其中柚皮素來源于赤芍、枳實,既往研究顯示,柚皮素通過減輕炎癥反應及氧化應激、抑制血管SMC增殖和遷移[32]、改善脂代謝[33]、抗血小板聚集[34]等防治AS及冠心病。目前關于mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚干預冠心病的相關研究較少,作用機制有待進一步驗證。網絡中一些化學成分來源于三參通脈合劑中的多味中藥,且與較多冠心病靶點相連,可能是三參通脈合劑治療冠心病的物質基礎。其中木犀草素來源于三參通脈合劑中3味藥物,與38個靶點相連;槲皮素來源于4味藥物,與38個靶點相連;山柰酚來源于7味藥物,與37個靶點相連。既往研究顯示,木犀草素、槲皮素、山柰酚通過調節脂代謝[35-36]、抗炎及抗氧化應激[35-39]、抑制SMC增生[40]等方面抗AS;可擴張血管、抗血小板聚集[36]防治冠心病;對心肌缺血再灌注損傷有保護作用[36,38-39]。

基于文獻發現一些已知藥物的主要藥效成分在網絡中與較多靶點相連。丹參主要成分丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、隱丹參酮(cryptotanshinone)均與22個靶點相連。既往研究顯示,丹參酮ⅡA通過抗炎[41]、抑制SMC增殖并誘導凋亡[42-43]、抗血小板聚集[44]等機制干預冠心病。隱丹參酮可改善缺血區供血[45]、抑制SMC增殖[46]等。延胡索主要成分去氫延胡索甲素(dehydrocorydaline)在網絡中與36個靶點相連。相關研究表明,去氫延胡索甲素可擴張冠狀動脈,增加冠狀動脈血流[47];作用于二磷酸腺苷(ADP)受體(P2Y1和P2Y12)以抗血小板聚集[48];抑制巨噬細胞炎癥以改善動脈順應性,增加斑塊穩定性[49];降低鈣超載,保護缺血心肌[50]。

3.2 三參通脈合劑治療冠心病的潛在靶點分析

本研究PPI網絡中Degree值排名居前10位的靶點為ALB、AKT1、GAPDH、VEGFA、IL1B、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、CASP3。綜合考慮“中藥-成分-靶點”網絡中的重要性,AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3可能在三參通脈合劑治療冠心病中發揮關鍵作用,主要涉及炎癥反應、細胞異常增殖、細胞凋亡等。

相關研究顯示,Src蛋白激酶通過細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)信號通路、p38絲裂原活化蛋白激(p38 MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路等,參與EC的炎癥反應、誘導巨噬細胞吞脂和遷移、刺激血管SMC遷移及增殖[51],參與AS整個病理過程;Src可促進血小板活化和血栓形成[52]。STAT3所屬的STAT蛋白家族是酪氨酸蛋白激酶-信號轉導和轉錄激活因子(JAK-STAT)信號級聯的一部分,參與調控機體免疫反應、血管EC及SMC的遷移與增殖、血管SMC凋亡等[53]。有研究顯示,JAK/STAT信號通路及其內源性細胞因子信號抑制物(SOCS)在AS炎癥反應中有雙向調控作用[54]。EGFR參與調控AS進程中SMC、EC及單核細胞/巨噬細胞的增殖與遷移,促進AS發展[55]。有研究顯示,EGFR表達減少引起循環中骨髓源性循環內皮祖細胞(EPCs)數量減少,活性降低,不利于EC損傷修復,參與冠心病的發病機制[56]。CASP3、AKT1等靶點與細胞凋亡密切相關,細胞凋亡參與冠心病的病理過程,導致斑塊不穩定、易于破裂,促進血栓形成,誘發冠狀動脈痙攣;細胞凋亡是心肌梗死的方式之一,與心肌再灌注損傷密切相關,可能促使心力衰竭演化[57]。阻斷或減少心肌細胞凋亡對治療冠心病有重要意義。CASP3所在Caspase家族是參與和執行細胞凋亡的關鍵,在細胞凋亡過程中處于核心位置;AKT是PI3K/AKT信號通路的主要參與者,對細胞凋亡有負性調節作用。AKT1活化后通過Caspase家族、Bcl-2家族、Par-4、轉錄因子家族、代謝途徑等調節細胞凋亡[58]。冠心病涉及多個病理過程,炎癥反應、細胞異常增殖、細胞凋亡等機制不是絕對獨立存在,而是互相作用,共同參與形成冠心病發生發展機制的復雜網絡。三參通脈合劑的潛在有效成分可能在多方面發揮作用,進而干預冠心病及AS。

3.3 三參通脈合劑治療冠心病KEGG通路富集分析

KEGG富集分析顯示,三參通脈合劑治療冠心病可能與脂質和AS途徑、流體剪切應力和AS途徑、Ca2+信號通路、cAMP信號通路、輔助性T細胞17(Th17)細胞分化通路、NF-κB信號通路、脂肪細胞脂解調節途徑等相關,主要涉及脂質代謝、炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡等機制。

脂質和AS途徑、脂肪細胞脂解調節途徑等提示三參通脈合劑干預冠心病可能與調節脂質代謝相關。AS動脈血管壁內斑塊富含脂質,低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高,積聚于血管壁,生成氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL),導致內皮功能障礙,促進冠心病進展,調節脂質代謝,降低LDL-C水平可防治冠心病。有研究顯示,脂肪細胞脂解調節途徑使巨噬細胞中脂滴穩定性升高,進而改善巨噬細胞極性和炎癥反應,在危險因素未變化的情況下,防治AS進展[59]。NF-κB信號通路、Th17細胞分化通路等與調節炎癥反應相關。AS是一種進展緩慢的慢性炎癥疾病。炎癥伴隨從早期EC修飾脂質激活到斑塊的破裂的AS全過程,并促進AS進展。NF-κB信號通路可從多種途徑激活NF-κB。既往研究顯示,NF-κB控制AS相關細胞因子、趨化因子、黏附分子、急性期蛋白、凋亡調節因子和增殖刺激因子等基因的轉錄,對AS有調節作用[60]。Th17在慢性炎癥疾病中有促炎作用,有研究顯示,AS進展與增殖激活的Th17細胞相關,在白細胞介素(IL)-18缺乏情況下,高膽固醇飲食小鼠中膽固醇與同型半胱氨酸通過替代的IL-23/Th17通路協同加速AS[61]。流體剪切應力和AS途徑提示在動脈分叉、分支開口和彎曲處往復運動、低剪切應力的擾動流促進動脈壁的氧化、炎癥狀態和AS發展[62]。血管SMC的異常增殖和遷移受cAMP/PKA信號通路調控。有研究顯示,質子感應受體T細胞死亡偶聯基因8(TDAG8)通過cAMP/PKA信號通路介導血管SMC的增殖和遷移[63],參與AS發生發展。阿司匹林可抑制cAMP信號通路,下調血管SMC增殖率,上調血管SMC凋亡率,抑制AS進展[64]。鈣信號通路調節鈣穩態,鈣超載促使心肌細胞凋亡、EC損傷,導致冠心病進展[65]。總之,主要的KEGG富集通路與冠心病及AS發生發展相關,三參通脈合劑可能通過調節上述信號通路脂質代謝、炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡,從而干預冠心病及AS進展。

3.4 分子對接結果分析

分子對接是基于分子水平預測并評價藥物小分子與靶點蛋白的相互作用,分析體的結合位點及二者的結合親和力,在分子結構方面補充網絡藥理學的預測能力。本研究使用AutoDock軟件進行分子對接,該軟件基于格點能量的計算方法,將靶點蛋白嵌入網格中,在每個網格點放置1個探針原子,軟件中AutoGrid程序將計算探針與目標之間的相互作用能,將數值存儲在網格中[66]。在模擬對接階段,AutoDock Vina程序根據構象搜索算法探索藥物小分子對接的構象狀態,并根據AutoGrid生成的能量網格評估對接模擬中每個點配體-受體的相互作用,二者結合力由自由結合能評價,自由結合能越低提示結合越緊密。

本研究對11個小分子化合物與5個核心靶點產生的55個組合以剛性受體-柔性配體的方式進行分子對接,即允許配體調整可旋轉鍵。55組對接結合能均<-20.93 kJ/mol,提示結合活性均較好,其中有25組屬于“中藥-成分-靶點”網絡,平均對接結合能為-32.40 kJ/mol,為網絡藥理學預測結果增加了分子結構上的可信度。網絡Degree值居前5位的化合物中,mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚干預冠心病的機制缺少文獻與研究的支持,與冠心病核心靶點AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3等結合活性較強,可能為今后治療冠心病提供新的藥物小分子選擇。30組網外組合平均對接結合能為-31.52 kJ/mol,對接活性良好,為三參通脈合劑主要藥物小分子干預冠心病的作用機制提出更多可能,值得進一步研究。總之,分子對接從分子水平解釋藥物小分子干預冠心病的作用機制提供了潛在依據,為冠心病基礎研究尚未關注到的潛在小分子化合物提出新的可能性,增加了網絡藥理學研究結果的完整性與可靠性。

4 小 結

本研究基于網絡藥理學研究方法,預測三參通脈合劑作用于冠心病的主要成分與核心靶點,進行GO富集分析與KEGG富集分析預測主要涉及的分子功能、生物進程與信號通路。結果提示三參通脈合劑主要活性成分包括柚皮素、木犀草素、槲皮素、山柰酚、去氫延胡索甲素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等有相關研究支持的成分與mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚等有待繼續研究的成分,可能主要通過SRC、STAT3、NF-κB信號通路、Th17細胞分化通路等抑制炎癥反應;通過EGFR、cAMP信號通路等抑制SMC、EC等的增殖與遷移;通過AKT1、CASP3、Ca2+信號通路等下調心肌細胞凋亡;通過調節脂質代謝穩定斑塊、降低危險因素等多種機制干預冠心病及AS的發生發展。本研究對核心靶點與主要活性成分進行分子對接,結果顯示,所有預測的對接組合結合活性均較好,在物質結構方面增強了預測意義,可能為今后干預冠心病研究提供潛在選擇。網絡藥理學研究結果是基于已有研究及實驗數據,其可靠性受原始研究結果準確性影響較大;網絡藥理學研究方法弱化了各成分的含量關系,篩選潛在藥用成分條件理想化,上述局限性可能導致本研究結果的假陽性與假陰性。本研究提供了今后冠心病研究的潛在方向,尚需大量針對性實驗驗證,深入探討三參通脈合劑干預冠心病的藥理學機制。