基于Nox4/PKCα/Gal-3通路探討柴胡皂苷D對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響

李耀征,白保強,孫亞勤,王 賀

心肌梗死是一種死亡率較高的心血管疾病,多數病人因冠狀動脈血栓、動脈粥樣硬化引發,若不能及時治療,導致心肌炎癥損傷和纖維化,心功能障礙,最終造成心力衰竭,嚴重影響病人生命健康[1-3]。炎癥反應在心肌梗死的病理生理過程中發揮著關鍵作用,抑制炎性因子白細胞介素(IL)-1β、IL-1、IL-6等表達,下調致纖維化因子轉化生長因子(TGF)-β1表達,減輕心肌炎癥和纖維化,緩解心肌梗死引發的心臟重構過程[4-5]。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)和蛋白激酶Cα(protein kinase C-alpha,PKCα)是調控炎癥及氧化應激的重要蛋白酶,激活兩者活性,促使活性氧生成,并上調半乳糖凝集素3(galectin3,Gal-3)表達,引發組織細胞嚴重的炎癥反應和過氧化損傷;下調Nox4,可抑制PKCα和Gal-3表達,減輕心肌炎癥損傷,抑制心肌成纖維細胞激活,改善心肌梗死后的不良心臟重塑[6-7],由此可知,Nox4/PKCα/Gal-3通路是防治心肌梗死后心肌纖維化的靶點之一。柴胡皂苷D是常用中藥柴胡中的主要活性成分,通過抑制核轉錄因子(NF)-κB信號轉導發揮抗炎作用,維持阿爾茨海默病小鼠海馬神經元正常形態,減少凋亡,減輕軟骨組織炎癥,抑制軟骨細胞凋亡,改善骨關節炎癥狀[8-9]。張潔等[10]研究顯示,柴胡皂苷D通過增加急性心肌梗死大鼠抗氧化能力,減輕心肌炎癥損傷,保護心功能。本研究基于Nox4/PKCα/Gal-3通路探討柴胡皂苷D對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠由南京青龍山實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(蘇)-2018-0001,無特定病原體(SPF)級,雄性,體質量180～210 g,飼養在醫院實驗動物中心,嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求進行飼養,動物房溫度23～25 ℃,濕度50%～55%,噪聲≤50 dB。

1.1.2 實驗試劑與儀器

柴胡皂苷D購自上海吉至生化科技有限公司(HPLC≥98%),貨號S15760;Apocynin購自美國Selleck Chemicals公司,貨號S2425;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒、IL-6酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA裂解液購自南京建成生物工程研究所,貨號分別為D006-1-1、D026-1-3、H007、A045-4-2、W062-1-1;IL-1β ELISA試劑盒、TGF-β1ELISA試劑盒、兔源β-actin一抗、兔源Nox4一抗、兔源PKCα一抗、兔源Gal-3一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司,貨號分別為ab255730、ab119558、ab8227、ab133303、ab32376、ab76245、ab150077等。VisualSonics超高分辨率小動物超聲成像系統購自百思德生物科技(北京)有限公司;HED-SY96S酶標儀購自山東霍爾德電子科技有限公司;CM1950冰凍切片機、Olympus CKX41光學顯微鏡購自德國徠卡公司;1659001蛋白電泳儀、Power-pac 3000轉膜儀購自美國Bio-Rad公司;JS-1090P化學發光凝膠成像系統購自上海培清科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型大鼠制備及分組給藥

參考文獻[11]中方法制備心肌梗死模型大鼠:配制2.5%戊巴比妥鈉溶液作為麻醉藥,取SD大鼠52只,以30 mg/kg劑量腹腔注射,之后將大鼠仰臥固定在操作臺,胸部備皮、消毒,切開胸骨左側第4肋間、第5肋間,暴露心臟,小心分離冠狀動脈左前降支結扎,至左心室顏色變白,還納心臟,關閉胸腔,縫合傷口,即完成心肌梗死模型制備,大鼠死亡4只,成功造模48只。隨機分為模型組、柴胡皂苷D(50 mg/kg)組、Apocynin(10 mg/kg)組、柴胡皂苷D+Apocynin組(柴胡皂苷D 50 mg/kg+Apocynin 10 mg/kg),每組12只。另選取12只SD大鼠只暴露心臟后分離冠狀動脈左前降支,不結扎,設定為假手術組。

柴胡皂苷D及Apocynin溶于生理鹽水,配制成5 mg/mL柴胡皂苷D藥液[10]、1 mg/mL Apocynin藥液[12]、5 mg/mL柴胡皂苷D和1 mg/mL Apocynin混合藥液,各藥物組大鼠均以10 mL/kg的劑量腹腔注射,假手術組、模型組給予等劑量生理鹽水,每日給藥1次,持續14 d。

1.2.2 超聲檢測大鼠心室功能

用藥結束后24 h,將大鼠麻醉后仰臥固定,采用小動物超聲多普勒血流儀檢測各組大鼠左心室功能,通過超聲心動圖檢查得到心室功能指標左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 大鼠標本采集

超聲檢查結束后,使用注射器抽取4 mL頸動脈血,離心后,收集上清保存在-80 ℃冰箱中;之后處死大鼠,開胸分離心臟,剪取約0.5 g左心室心肌組織(于每只大鼠左心室相同位置采樣)保存在液氮中,剩余組織浸入OCT包埋劑中,置于液氮中快速冰凍,采用冰凍切片機進行切片。

1.2.4 HE及Masson染色

將左心室心肌組織切片于冷丙酮中固定,經蒸餾水漂洗后,通過試劑盒進行HE及Masson染色,各染色5張,于顯微鏡下觀察染色情況,每張切片選取5個視野拍照,以Image J軟件分析心肌組織膠原容積積分(collagen volume fraction,CVF),CVF=(心肌膠原面積/所測視野面積)×100%。

1.2.5 血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平測定

將頸動脈血清提前解凍,采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TGF-β1水平,具體操作按照試劑盒說明指導進行。

1.2.6 心肌組織中Nox4/PKCα/Gal-3通路相關蛋白表達

取左心室心肌組織,加入1 mL RIPA裂解液,通過勻漿機制成勻漿液,4 ℃離心,取上清,以BCA法測定蛋白總濃度,配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠和濃縮膠,取含20 μg蛋白的各組樣品液加入上樣孔中,通過電泳儀進行電泳,之后濕轉,將分離蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%的脫脂奶粉溶液封閉蛋白,分別加入兔源Nox4、PKCα、Gal-3、β-actin一抗,4 ℃孵育10 h,以TBST洗膜,加入羊抗兔二抗,室溫孵育1.5 h,以TBST洗膜,使用凝膠成像系統拍照,通過Image-J軟件分析蛋白條帶灰度值,得到各蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織形態學改變

假手術組大鼠心肌組織形態正常,無病理損傷;模型組大鼠出現心肌細胞壞死、細胞間隙增大、心肌纖維斷裂、組織腫脹等病理損傷;相較于模型組,各藥物組大鼠心肌組織病理損傷減輕;相較于柴胡皂苷D組、Apocynin組,柴胡皂苷D+Apocynin組大鼠心肌組織病理損傷進一步減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學改變(HE染色,×200)

2.2 各組大鼠心肌組織纖維化變性

相較于假手術組,模型組大鼠心肌組織間隙有膠原增生,CVF升高(P<0.05);相較于模型組,各藥物組大鼠心肌組織間隙膠原增生減少,CVF降低(P<0.05);相較于柴胡皂苷D組、Apocynin組,柴胡皂苷D+Apocynin組大鼠心肌組織間隙膠原增生進一步減少,CVF降低(P<0.05)。詳見圖2、表1。

表1 各組大鼠心肌組織CVF比較(±s) 單位:%

圖2 各組大鼠心肌組織纖維化變性(Masson染色,×200)

2.3 各組大鼠心功能指標比較

相較于假手術組,模型組大鼠LVEDD及LVESD升高(P<0.05),LVEF及LVFS降低(P<0.05);相較于模型組,各藥物組大鼠LVEDD及LVESD降低(P<0.05),LVEF及LVFS升高(P<0.05);相較于柴胡皂苷D組、Apocynin組,柴胡皂苷D+Apocynin組大鼠LVEDD及LVESD降低(P<0.05),LVEF及LVFS升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較(±s)

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平比較

相較于假手術組,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平升高(P<0.05);相較于模型組,各藥物組大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低(P<0.05);相較于柴胡皂苷D組、Apocynin組,柴胡皂苷D+Apocynin組大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.5 各組大鼠心肌組織Nox4/PKCα/Gal-3通路相關蛋白表達

相較于假手術組,模型組大鼠心肌組織Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表達升高(P<0.05);相較于模型組,各藥物組大鼠心肌組織Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表達降低(P<0.05);相較于柴胡皂苷D組、Apocynin組,柴胡皂苷D+Apocynin組大鼠心肌組織Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表達降低(P<0.05)。詳見圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌組織Nox4/PKCα/Gal-3通路相關蛋白相對表達比較(±s)

圖3 各組大鼠心肌組織Nox4/PKCα/Gal-3通路相關蛋白表達條帶圖(A為假手術組;B為模型組;C為柴胡皂苷D組;D為Apocynin組;E為柴胡皂苷D+Apocynin組)

3 討 論

我國心肌梗死發病率逐年上升,且發病年齡日益年輕化,心肌梗死病人治療窗口期短,易引發心肌肥厚、慢性心力衰竭等后遺癥,是臨床醫學中亟須解決的難題[13-14]。心肌梗死發生后,心臟組織發生心臟重塑,心肌纖維化是其中關鍵部分,心肌梗死后心肌組織缺血缺氧,引發心肌炎癥,進而誘導心肌成纖維細胞激活,造成心肌纖維化[15-16]。本研究通過結扎心臟冠狀動脈左前降支構建心肌梗死模型,結果顯示,造模大鼠心肌細胞壞死,細胞間隙增大,組織腫脹,心肌纖維斷裂,且心肌間隙有明顯的膠原增生,心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平升高,LVEF及LVFS降低,表明結扎心臟冠狀動脈左前降支后,引發大鼠嚴重炎癥反應,損傷心肌組織,誘導心肌纖維化,進而導致心室功能障礙,提示心肌梗死模型建立成功。

炎癥在心肌梗死病理生理過程中發揮著重要的作用,可誘導心肌纖維化[4-5]。柴胡皂苷D是中草藥柴胡中含有的一類皂苷衍生物,具有抗菌、抗炎、抗纖維化等多種藥理活性,可減輕四氯化碳導致的大鼠肝組織炎癥壞死和纖維化變性,并減輕過氧化氫(H2O2)和心肌梗死誘導的心肌細胞氧化應激反應,減少活性氧產生,保護心肌組織[10,17-18]。本研究以柴胡皂苷D處理心肌梗死大鼠,觀察其對心肌梗死后心肌纖維化的影響,結果顯示,心肌梗死大鼠經柴胡皂苷D處理后,大鼠心肌組織病理損傷減輕,心肌間隙膠原增生減少,心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低,LVEF及LVFS升高,表明柴胡皂苷D可下調炎性因子和致纖維化因子表達,抑制心肌梗死引發的心肌炎癥,減輕心肌損傷及纖維化變性,改善心室功能。

Nox4/PKCα/Gal-3是調控炎癥發生發展的重要信號通路,在高糖誘導的炎性損傷過程中Nox4、PKCα處于激活狀態,下調兩者表達,可減少活性氧生成,進而抑制炎癥反應,減輕人視網膜內皮細胞向間充質轉化,緩解糖尿病導致的組織器官纖維化;Gal-3是Nox4/PKCα的下游信號因子,下調其表達,改善皮膚炎癥; Nox4/PKCα/Gal-3信號在心肌梗死后心肌纖維化過程中發揮著關鍵的調控作用,抑制其激活,可改善心肌梗死后的心肌纖維化導致的心臟重塑[7,19-20]。本研究中心肌梗死大鼠心肌組織Nox4、PKCα及Gal-3蛋白表達升高,以Nox4抑制劑Apocynin處理心肌梗死大鼠后,發現其可減輕大鼠心肌組織病理損傷及間隙膠原增生,并降低心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平,下調心肌組織Nox4、PKCα及Gal-3蛋白表達,升高LVEF及LVFS,與柴胡皂苷D對心肌梗死大鼠的作用相似,表明Nox4/PKCα/Gal-3通路參與心肌梗死大鼠的心肌纖維化過程,柴胡皂苷D可抑制其激活,減輕心肌纖維化;以柴胡皂苷D和Apocynin聯合處理心肌梗死大鼠,較單獨使用,可進一步增強柴胡皂苷D的作用,表明柴胡皂苷D和Apocynin可協同抑制心肌梗死引發的心肌炎癥損傷和纖維化變性,進一步提示柴胡皂苷D可能通過抑制Nox4/PKCα/Gal-3通路激活,緩解心肌梗死后心肌纖維化。

綜上所述,柴胡皂苷D可下調Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表達,抑制炎癥發生,減輕心肌損傷及纖維化變性,改善心室功能,抑制Nox4/PKCα/Gal-3通路激活可能是其藥理機制之一。本研究僅進行了初步研究,證據稍顯不足,今后應通過激活Nox4/PKCα/Gal-3通路進行對照驗證。