基于miR-155/BDNF/TrkB軸探討西紅花酸對急性心力衰竭大鼠心功能及心室重構的影響

王琰淏,李 燕,張松雨,周曉鐸,王 穎

心力衰竭是多種心臟疾病發(fā)展到終末期的嚴重并發(fā)癥,急性心力衰竭通常是慢性心力衰竭急性失代償,引發(fā)心力衰竭,癥狀及體征急速惡化[1]。流行病學調查顯示,我國心力衰竭年新增病人數(shù)量逐年增加,發(fā)病率與年齡呈正相關,且預后差,5年病死率超過60%[2]。因此,尋找有效的治療急性心力衰竭藥物,對改善預后、提升后期生存率意義重大。西紅花是我國名貴中藥材,具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒的功效,治療月經(jīng)不調、經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀血腰痛等婦科疾病及冠心病、心絞痛等心腦血管疾病療效顯著[3]。西紅花酸是西紅花主要活性成分之一,體外實驗研究表明,西紅花酸可抑制大鼠心肌細胞中的Ca2+瞬變和收縮力,提示其具有治療心血管疾病的潛在作用[4]。然而,目前關于西紅花酸治療急性心力衰竭的研究較少。本研究通過建立急性心力衰竭大鼠模型,采用西紅花酸干預,觀察其對該病的治療效果,以期為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體(SPF)級SD大鼠45只,雄性,8周齡,體質量(300±20)g,購自上海杰思捷實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2018-0004。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

西紅花酸(純度99%,上海滬震實業(yè)有限公司),微小RNA(microRNA,miR)-155激活劑腺病毒(上海漢恒生物科技有限公司),逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒,雙熒光素酶檢測試劑盒(上海群己生物科技有限公司),兔抗大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine receptor kinase B,TrkB)、p-TrkB一抗(英國Santa公司)。

VEVO3100小動物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司),PowerLab 多導生理記錄儀(澳大利亞ADInstruments公司),SAR1000動物呼吸機(上海牧榮生物科技有限公司),STELLARIS DLS顯微鏡(德國Leica公司),Scientific MK3酶標儀、E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 急性心力衰竭模型的建立

參照相關文獻[5],取全部SD大鼠,腹腔注射25%烏拉坦麻醉后四肢仰臥固定于手術臺,生理記錄儀電極連接大鼠四肢,頸部、腹部及胸腔部位備皮消毒,切開頸部后分離氣管,切開一小孔行氣管插管術,連接呼吸機,行開胸術,暴露心臟,隨機選取10只大鼠不處理設置為Sham組,剩余大鼠將心包撕開,縫合線穿過左心耳下結扎,以左心室表面顏色變白,心臟脈動減弱,內(nèi)壓最大上升速度(dp/dtmax)至標準值60%以下且持續(xù)5 min不上升為建模成功標準,縫合胸腔,待大鼠呼吸平穩(wěn)后撤去呼吸機,縫合頸部皮膚,術后注射青霉素鈉1×105U防止感染,每日1次,持續(xù)3 d。除Sham組外,將剩余大鼠隨機分為急性心力衰竭組、Crocetin組、Crocetin聯(lián)合轉染組,剔除建模失敗及后續(xù)實驗死亡的大鼠后,每組均納入10只。

1.4 干預方式

參照相關文獻[6]方法,建模過程結束后次日,Crocetin聯(lián)合轉染組大鼠左心腔內(nèi)注射100 μL miR-155激活劑腺病毒(5×1012μg/mL),同時動脈夾夾緊主動脈15 s,2 h后,將西紅花酸溶于二甲基亞砜(DSMO)腹腔注射,Crocetin組、Crocetin聯(lián)合轉染組均含西紅花酸100 mg/kg,Sham組、急性心力衰竭組腹腔注射等量DSMO。每日1次,持續(xù)2周。

1.5 大鼠心功能指標及心室重構指標檢測

末次干預后2 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,將小動物超聲成像系統(tǒng)探頭置于左室長軸切面,獲取M型超聲心動圖,測量心功能指標左室射血分數(shù)(left ventricle ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)及心室重構指標左室后壁厚度(left ventricular posterior wall,LVPW)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)。連續(xù)測量3個心動周期,取平均值。

1.6 組織取材

超聲心動圖檢查后,脫頸處死大鼠,切取部分心肌組織,分成3份,一份固定于4%多聚甲醛中24 h,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,病理切片機切為4 μm切片,用于蘇木精-伊紅(HE)染色;兩份置于液氮中保存用于qRT-PCR實驗及蛋白檢測。

1.7 HE染色觀察心肌組織病理變化

取各組心肌組織切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,采用常規(guī)HE染色,封片劑封片,置于光鏡下觀察心肌組織病理學改變,并拍照記錄。

1.8 心肌組織miR-155表達量測定

取液氮中保存的心肌組織,剪碎后充分研磨,采用Trizol法提取心肌組織總RNA,逆轉錄試劑盒獲得互補鏈cDNA,進行實時熒光定量PCR反應,根據(jù)試劑盒說明書設計實驗步驟,設置反應體系:Taq酶10 μL,10 μmol/L正向、反向引物各1 μL,ddH2O 10 μL,2×SYBR Green PCRmix 5 μL;反應條件:95 ℃預變性2 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,重復40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因,2-△△Ct為目的基因的相對表達量,所有實驗重復3次取Ct平均值。實驗引物:miR-155正向引物5′-TCAAGCCTGACGTACGTTGCACGT-3′,反向引物5′-CGTAACGTTGCGTGTCCACAGGTC-3′;U6正向引物5′-CCGTACGTGCACCACAGTGCTTAA-3′,反向引物5′-GTCACGTGTGCACCGTGTGCCACA-3′。

1.9 雙熒光素酶實驗驗證miR-155與BDNF的靶向關系

采用miRNA靶向基因預測工具TargetScan預測,含有miR-155結合位點的BDNF 3′-UTR,鑒定報告結果由上海群己生物科技有限公司提供。構建熒光素酶報告系統(tǒng)載體質粒,通過PCR技術構建熒光素酶載體質粒,獲取野生型BDNF 3′-UTR基因片段和突變型BDNF 3′-UTR基因片段,分別命名為BDNF 3′-UTR-WT、BDNF 3′-UTR-MT,構建至雙熒光素酶報告基因質粒中。將BDNF 3′-UTR-WT、BDNF 3′-UTR-MT、miR-155質粒(miR-155 mimic、miR-155 mimic-NC)共轉染至293T細胞,形成4個轉染組:BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic組。轉染完成后24 h,根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟設計操作,經(jīng)酶標儀檢測熒光強度。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.10 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白表達

取液氮保存的各組心肌組織,剪碎后充分研磨,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌勻漿,注入離心管中,加入預冷的RIPA細胞裂解液裂解,以8 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取50 μg樣品與上樣緩沖液等比例混合,金屬浴加熱5 min,相同條件下離心取上清,恒壓80 V行上樣電泳分離,濕法轉至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗膜,加入兔抗大鼠BDNF、TrkB、p-TrkB一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育2 h,TBST洗膜,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜,電化學發(fā)光(ECL)法發(fā)光顯色,置于暗室內(nèi)曝光,采用一體式凝膠成像系統(tǒng)拍照分析條帶灰度值,以BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白相對表達量,計算p-TrkB/TrkB。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組心功能指標比較

與Sham組比較,急性心力衰竭組LVEF、LVFS降低(P<0.05);與急性心力衰竭組比較,Crocetin組LVEF、LVFS升高(P<0.05);與Crocetin組比較,Crocetin聯(lián)合轉染組LVEF、LVFS降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組心功能指標比較(±s) 單位:%

2.2 各組心室重構指標LVPW、LVEDD、LVESD比較

與Sham組比較,急性心力衰竭組LVPW、LVEDD、LVESD增加(P<0.05);與急性心力衰竭組比較,Crocetin組LVPW、LVEDD、LVESD減少(P<0.05);與Crocetin組比較,Crocetin聯(lián)合轉染組LVPW、LVEDD、LVESD增加(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心室重構指標LVPW、LVEDD、LVESD比較(±s) 單位:mm

2.3 各組大鼠心肌組織病理變化

HE染色結果顯示,Sham組心肌纖維排列整齊、有序,未發(fā)現(xiàn)明顯變性、壞死及間質中炎性細胞浸潤;急性心力衰竭組心肌損傷嚴重,大量心肌細胞發(fā)生腫脹、壞死,心肌纖維間隙寬度增加,有明顯炎性細胞浸潤;相較于急性心力衰竭組,Crocetin組、Crocetin聯(lián)合轉染組心肌損傷減輕,腫脹、壞死心肌細胞數(shù)量減少,心肌纖維間隙寬度減小,炎性細胞浸潤減少,其中Crocetin組對心肌組織病理變化的改善效果優(yōu)于Crocetin聯(lián)合轉染組。詳見圖1。

2.4 各組心肌組織miR-155表達量比較

Sham組、急性心力衰竭組、Crocetin組、Crocetin聯(lián)合轉染組心肌組織miR-155表達量分別為(0.21±0.03)、(0.65±0.07)、(0.34±0.04)、(1.28±0.15)。與Sham組比較,急性心力衰竭組miR-155表達量升高(P<0.05);與急性心力衰竭組比較,Crocetin組miR-155表達量降低(P<0.05);與Crocetin組比較,Crocetin聯(lián)合轉染組miR-155表達量升高(P<0.05)。

2.5 雙熒光素酶實驗結果

雙熒光素酶結果顯示,BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic組的熒光素酶活性分別為(1.48±0.04)、(0.98±0.02)、(1.47±0.03)、(1.49±0.14)。與BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic組比較,BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-MT+NC mimic組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic組熒光素酶活性升高(P<0.05);BDNF 3′-UTR-WT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic-NC組、BDNF 3′-UTR-MT+miR-155 mimic組熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？芍狟DNF是miR-155的一個靶基因,兩者結合位點為BDNF的3′-UTR片段。詳見圖2。

圖2 miR-155預測靶基因及其結合位點

2.6 各組大鼠心肌組織BDNF蛋白表達、p-TrkB/TrkB比較

與Sham組比較,急性心力衰竭組BDNF蛋白表達、p-TrkB/TrkB降低(P<0.05);與急性心力衰竭組比較,Crocetin組BDNF蛋白表達、p-TrkB/TrkB升高(P<0.05);與Crocetin組比較,Crocetin聯(lián)合轉染組BDNF蛋白表達、p-TrkB/TrkB降低(P<0.05)。詳見表3、圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織BDNF、p-TrkB、TrkB蛋白表達條帶圖

表3 各組心肌組織BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白表達比較(±s)

3 討 論

心力衰竭是心臟功能或結構異常導致心臟收縮功能障礙,由其他多種病因引發(fā)的一系列綜合征[7],病理特征為體循環(huán)淤血伴隨器官低灌注,臨床表現(xiàn)為呼吸困難、頭暈、低血壓、體液潴留[8]。心室重構是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要發(fā)病機制,具體表現(xiàn)為心肌損傷后在神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)影響下,心室形狀、厚度、大小發(fā)生代償性病理變化,隨著心室重構的發(fā)展,心功能持續(xù)惡化,心室射血充盈能力下降,導致靜脈血排出受阻,動脈血無法充足供應,進而危及生命[9]。因此,抑制心室重構、改善心功能是臨床治療心力衰竭的重要研究方向。

本研究結果顯示,與急性心力衰竭組比較,Crocetin組LVEF、LVFS升高,LVPW、LVEDD、LVESD減少,HE染色結果顯示,Crocetin組較急性心力衰竭組病理改善顯著,提示西紅花酸可提高大鼠心功能,抑制心室重構,改善心肌組織病理變化。中醫(yī)學理論認為,心力衰竭歸屬于“心悸”“喘癥”“水腫”“積聚”等范疇,多為“心悸”“喘癥”并存,其病機為氣虛血瘀、陽虛水泛,即先天或后天因素導致五臟虧損、血氣虛虧、血運不暢、精化為水、瘀水互結,以致陰陽失衡、臟腑不調,繼而發(fā)病,故治療以益氣活血、溫陽利水為主[10]

西紅花又名番紅花、藏紅花,源自古希臘,早期傳入我國,為名貴中藥材,取自鳶尾科植物番紅花干燥柱頭,性平,味甘,歸心經(jīng)、肝經(jīng)。西晉《博物志》記載,西紅花可治心憂郁積,驚悸,氣悶不散,活血,久服令人心喜[11]。西紅花酸是西紅花主要藥用物質西紅花苷的水解物,具有抗凝血、抗動脈粥樣硬化、增加冠狀動脈血流量、抑制氧自由基和細胞凋亡、抗腫瘤等多種生物學活性[12]。Zhao等[13]研究顯示,西紅花酸通過抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡,減輕三氧化二砷治療引起的心臟毒性副作用,提示其對心臟具有保護作用。

miRNA參與目標基因轉錄調控基因表達,在細胞生長、組織器官發(fā)育及多種疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[14]。miR-155是機體重要的抗炎miRNA,在淋巴細胞、內(nèi)皮細胞內(nèi)表達,介導機體炎癥反應及細胞凋亡[15]。有研究顯示,下調巨噬細胞miR-155表達可改善心室重構,增強心臟功能,為急性心力衰竭后心室重構的干預提供了有效靶點[16]。BDNF是機體內(nèi)含量豐富的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布,是突觸信號傳遞速度和突觸可塑性的主要調節(jié)因子。TrkB是一種酪氨酸激酶受體,是BDNF高親和力特異性受體,其與BDNF結合后被激活產(chǎn)生二聚化,并自體磷酸化,激活下游信號級聯(lián)反應,在急性心力衰竭發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。本研究結果顯示,與Sham組比較,急性心力衰竭組miR-155表達量升高,提示miR-155在急性心力衰竭心肌組織細胞中異常高表達;經(jīng)雙熒光素酶實驗驗證顯示miR-155與BDNF存在結合位點,BDNF是其靶向調控基因之一。與Sham組比較,急性心力衰竭組BDNF蛋白表達、p-TrkB/TrkB降低,與西紅花酸聯(lián)用后可一定程度減弱轉染對急性心力衰竭的影響,提示西紅花酸抑制急性心力衰竭大鼠心室重構,提升心功能可能與調控miR-155、靶向調控下游BDNF/TrkB軸有關。

綜上所述,西紅花酸可抑制急性心力衰竭大鼠心室重構,提高心功能,其機制可能與調控miR-155、靶向調控BDNF/TrkB軸有關。中藥單體的作用機制復雜,關于西紅花酸治療急性心力衰竭是否存在其他機制仍需深入研究。