不同提取方法對水飛薊油揮發性化合物的影響

馬靜，韓黎曉，劉龍龍，張華*

1.延邊大學農學院（延吉 133002）；2.錫林郭勒職業學院（錫林浩特 026000）

水飛薊油是一種從干燥水飛薊種子中提取出來的新型植物食用油，作為提取水飛薊素的副產品，并未得到充分開發利用[1]。因此，有必要區分不同提取方法水飛薊油的揮發性有機化合物的組成和鑒定質量優劣。

水飛薊油的提取方法主要有機械壓榨法、水代法、生物酶輔助提取油法等[2-4]。機械壓榨法會降低食用價值[5]，水代法操作難度大[6]，超臨界萃取和臨界萃取對設備要求高[7-8]。生物酶輔助提取油法通過酶降解細胞壁從而釋放油脂，得到的油脂品質好、得率高[9]。

由于水飛薊油油脂的質量優劣不濟，近年來雖然也有將電子鼻技術[10-11]、紅外光譜[12]、核磁共振[13]等技術區分油脂質量，但很難從分子的角度判別油脂質量。胡謙等[14]采用UPLC-QTOF-MS技術通過對甘油酯的分析，從而對壓榨油和浸出油進行鑒別；Kurata等[15]通過電噴霧電離質譜快速鑒別42種植物油的脂肪酸組成。

基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（HS-SPMEGC-MS）用于區分酶法提取、溶劑提取和壓榨水飛薊油的揮發性有機化合物的組成和鑒定質量優劣研究尚未見諸報道。因此，試驗基于HS-SPME-GC-MS技術，比較不同提取方法的水飛薊油的揮發性化合物。結合無監督的多變量統計方法PCA、有監督的多變量統計方法PLS-DA和灰度關聯分析法區分不同方法提取的水飛薊油，并確定其質量優劣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水飛薊籽（安徽亳州鴻碩生物科技有限公司）；冷榨水飛薊油（延邊遠山油脂有限公司）。

無水乙醇、正己烷，均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

QP2010 Plus氣相-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源，日本島津公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭（美國Supelco公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 水飛薊油的制備

取500 g水飛薊籽放入粉碎機進行粉碎，粉碎后過0.180 mm（80目）篩，取100 g水飛薊籽粉末與300 mL溶液（正己烷-無水乙醇2∶1，V/V）混合置于1 000 mL錐形瓶中，添加3 mg/mL纖維素酶，在pH 4.5，45 ℃反應120 min后，于25 ℃恒溫搖床振蕩提取1 h，過濾，于55 ℃保持旋轉蒸發除去溶劑，轉移至樣品保存瓶中，氮氣吹干溶劑，得到水飛薊油樣品A（SMOA）。添加相同量正己烷后，在25 ℃搖床反應2 h后，重復上述操作，得到水飛薊油樣品B（SMOB）。另外，冷榨水飛薊油樣記為C（SMOC）。

1.3.2 樣品前處理

準確移取2.0 g油樣置于10 mL帶有隔墊的瓶蓋的頂空瓶中，密封，在60 ℃條件下攪拌平衡10 min，通過隔墊將已老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，吸附60 min，待氣相色譜-質譜聯用分析。

1.3.3 色譜條件

DB-5MS毛細管色譜柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm），進樣口溫度250 ℃，進樣方式為不分流，載氣為氦氣（He），柱流速1 mL/min，吹掃流量3.0 mL/min，分流比50∶1。升溫程序：起始溫度 40 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至200 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.3.4 質譜條件

離子源（EI）溫度200 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間2 min，電子能量70 eV，掃描質量范圍（m/z）40～550。利用質譜譜庫為NIST08和NIST08s質譜庫進行檢索，結果選擇匹配度≥95%的物質進行分析。

1.4 數據分析

通過Microsoft Excel 2016數據處理系統，運用面積歸一化法求得各揮發性成分的相對含量，將Metabioanalysis 5.0用于數據分析、PCA和PLS-DA模型的建立。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法的水飛薊油中揮發性化合物的GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS對不同提取方式的水飛薊油的揮發性有機化合物進行分析和鑒定，其結果如表1所示。共確定揮發性有機物43種，其中主要包括酯類9種、酸類4種、醇類6種、烷烴類12種、烯烴2種，醛類2種、吡嗪1種、其他類7種。3種樣品中SMOA的香氣最為濃郁，而SMOC的香氣最淡。SMOA中含有較高的4-羥基丁酸乙酰酯，4-羥基丁酸內酯和N-羥基苯甲酸甲酯等酯類物質，這類物質有濃郁的麥香和奶油的香氣。但濃度一定時，感覺閾值越低的化合物越容易被感知；感覺閾值一定時，濃度越高的化合物越容易被感知。從某一物質的含量判斷其是否為油脂中主要香氣成分不可靠，因此需進行數據降維，排除眾多化學信息共存時發生互相重疊的現象，根據主成分因子在不同樣本中不同的貢獻率從而評價樣本之間的規律性和差異性[21-22]。

表1 水飛薊油易揮發性有機化合物相對含量

2.2 不同提取方法的水飛薊油中揮發性化合物的GC-MS分析

2.2.1 基于PCA對不同提取方法的水飛薊油的區分

隨著信息技術的不斷發展，多元統計技術被廣泛應用于油脂各個領域。利用水飛薊油中有機揮發物含量進行PCA，如圖1所示。共獲得5個PC，累計R2=0.81，Q2=0.63，表明該模型擬合程度較好，預測能力較好，能夠很好地顯示樣品間的差異，PC1的方差貢獻率為85.2%，PC2的方差貢獻率為9.9%，2個主成分的貢獻率達95.1%，可以很好地代表樣品的所有信息。從樣品的離散和聚集程度上看，SMOA在PC1上與SMOB和SMOC有很大的區分，無重疊部分，PCA屬于無監督分析方法，不能忽略組內誤差、消除與研究目的無關的隨機誤差，因此，并不能直接區分不同提取方法的水飛薊油，因此，采用有監督的PLS-DA進行進一步研究。PLS-DA是有監督的分析，它可以彌補PCA的不足，消除組內差異，強化組間差異，量化特征化合物造成組分差異的程度[23]。建立PLS-DA模型前，為調整系統的樣本之間的差異對樣本進行總合歸一化處理，數據采用log對數處理。

圖1 基于水飛薊油的PCA得分圖

2.2.2 基于PLS-DA對不同提取方法的水飛薊油的區分

如圖2（a）所示，采用置換檢驗對PLS-DA模型進行驗證，重復100次，以獲取隨機模型的R2和Q2，可作為衡量模型是否過擬合的標準，結果顯示該模型并未出現過擬合現象（P＜0.01），模型可靠。如圖2（b）所示，驗證獲得隨機的R2和Q2，R2=0.99，Q2=0.97，表明模型不但準確可靠，且具有良好的預測能力，可用于解釋不同水飛薊油之前的揮發性有機物的差異。圖3為不同提取方法的水飛薊油PLS-DA得分圖，圖3顯示SMOA與SMOB和SMOC存在顯著差異，這一結果與PCA分析結果一致。

圖2 不同水飛薊油的置換檢驗圖（a）和置換保留圖（b）

圖3 不同水飛薊油的PLS-DA得分圖

2.2.3 不同水飛薊油的揮發性特征標志物的篩選與分析

基于PLS-DA分析結果，可用變量重要性投影（variable important for the projection，VIP）可量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，在統計學上，一般將VIP值大于1表示在判別過程中具有重要作用，VIP值越大，樣本間差異越大[24]。如圖4所示，共篩選出14種潛在揮發性標志物，其中有酯類4種、醇類2種、烷烴類3種。為更加直觀地觀察不同水飛薊油揮發性標志物，根據每個揮發性有機物的相對含量繪制熱圖，如圖5所示，SMOB和SMOC聚為1類，SMOA單獨為1類。由圖4可以看出，在VIP值大于1的物質中，SMOA中三甲基乙腈、新戊二醇、醋酸2-乙基乙酯、甲環丁烷和4-羥基丁酸內酯含量較高，是區分其他2組的主要標志物。而SMOB中3-甲基3-苯基苯甲酸酯含量較高，是區分其他2組的重要標志物。SMOC中季銨鹽-78, 2-乙基對二甲苯和環辛四烯含量較高，是區分其他2組的重要標志物。SMOA中酯類物質含量較高，且風味閾值較低，在SMOA中起著重要的作用，因此SMOA的味道更加濃郁。

圖4 不同提取方法的水飛薊油的VIP圖

圖5 不同方法提取水飛薊油揮發性標志物的熱圖

2.3 灰度關聯分析法判別水飛薊油質量

灰度關聯分析法對系統發展變化態勢提供量化的度量標準，根據關聯度的結果比較不同因素對整體樣本的影響[25]。為進一步明確3種不同提取方式的水飛薊油的質量優劣，運用灰度關聯分析法對VIP值大于1的物質進行統計分析。按式（1）計算。

式中：i=1, 2, 3分別表示SMOA，SMOB和SMOC對14組VIP值大于1的揮發性標志物的數據均值化處理。

利用式（2）求得絕對差值。

依據式（3）求出關聯系數，式中ρ為分辨系數，取0.5，關聯系數結果見表2。

表2 關聯系數結果表

計算出各揮發物的權重，將權重帶入綜合評分式（5）。

不同提取方式的水飛薊油綜合評分見表3。結果表明，SMOA的揮發性標志物綜合評分最高，說明由酶法提取的水飛薊油氣味最優，其次是SMOB，氣味最差的是SMOC，這一結果水飛薊油的氣味優劣與提取方式密切相關。

表3 不同方式所得水飛薊油揮發性特征物的綜合評分

3 結論

采用UPLC-QTOF-MS對不同方法提取的水飛薊油揮發性有機化合物進行檢測，共分析出43種揮發性有機物，其中酯類9種、酸類4種、醇類6種、烷烴類12種、烯烴2種、醛類2種、吡嗪1種、其他類7種。結合多元統計方法分析得出VIP大于1的揮發性物質14種，對SMOA有重要影響的5種，SMOB中1種、SMOC中3種，SMOA揮發性香氣物質含量最高，含有較高的4-羥基丁酸乙酰酯、4-羥基丁酸內酯和N-羥基苯甲酸甲酯等。結合灰度關聯分析法可知：SMOA關聯度0.808，油脂質量最佳；SMOB關聯度0.711，油脂質量次之；SMOC關聯度0.703，油脂質量最差；說明由酶法提取的水飛薊油氣味最優。因此，酶法輔助復合溶劑提取水飛薊油可最大程度地保留油脂中揮發性成分，香氣最為濃郁。我國水飛薊油提取率仍較低，應用規模較小，提取出的產品質量也較差，因此水飛薊油酶提取法提取及運用有著重要意義。