淫羊藿苷聯合針灸對深靜脈血栓大鼠氧化應激、TXB2/6-Keto-PGF1α及Nrf2/HO-1信號通路的作用

劉靜 李玉燕 伊俊豪 武雨俠 鄧永健

(新疆阿勒泰地區中醫醫院(阿勒泰地區哈薩克醫醫院),新疆 阿勒泰 836500)

深靜脈血栓(DVT)是一種靜脈回流障礙性疾病,血液在血管內發生凝結后阻塞血管所導致的高發疾病〔1〕。DVT流行病學研究證實,全球每年DVT死亡人數約1 500萬人,發病率高達1/1 000,因早期靜脈血栓栓子可隨著血液循環達到肺部誘發肺部栓塞,具有高死亡率及易漏診等特點,嚴重威脅患者生命安全〔2〕。氧化應激是指機體細胞或組織氧自由基升高或清除活性氧自由基(ROS)能力降低而誘發的氧化損傷過程。在病理條件下氧化應激可增加血管內皮功能損傷,主要是通過促進炎癥因子激活而加快血管系統障礙而加快DVT形成〔3〕。這與以往學者研究的氧化應激與多種心血管疾病發展密切相關的研究類似〔4〕。核因子-E2相關因子(Nrf)2是氧化應激敏感因子,可被諸多因素如ROS、抗氧化劑等激活進入細胞核,與抗氧化反應元件(ARE)結合,調控體內多種抗氧化酶的表達,從而發揮抗氧化作用〔5〕。血紅素加氧酶(HO)-1能夠通過降解亞鐵血紅素生成一氧化碳等產物參與氧化應激損傷等病理生理過程。以往研究證實,在DVT產生時存在血栓素(TX)A2/前列腺素(PG)F1α表達異常,TXA2具有促進血小板聚集和加快血管收縮的作用,PGF1α與之存在相反作用,能夠抑制血小板聚集發揮血管擴張作用,在非病理條件下兩者處于動態平衡階段但是在DVT病理條件下兩者存在不穩定性,可轉化為TXB2和 6-Keto-PGF1α,增加血管斑塊聚集從而加重病情〔6〕。

目前對DVT的治療主要以西藥為主,但是西藥用藥安全性和毒副作用仍處于討論階段。中藥在治療DVT具有較大優勢和潛力。淫羊藿苷是從淫羊藿總黃酮中提取的有效成分,可在葉淫羊藿、柔毛淫羊藿等干燥莖葉中提取,具有改善腦缺血缺氧、減少心肌梗死及增加抗氧化酶活性的作用〔7〕。針刺是我國傳統治療方式之一,經絡與五臟六腑之間關聯密切。長期以來,針灸在治療腦卒中、高血壓及糖尿病等方面療效較好,被認為能夠發揮調氣利血、溫經通絡作用〔8〕。但是將淫羊藿苷聯合針灸治療DVT的治療研究較少,因此本文通過建立DVT大鼠模型觀察淫羊藿苷聯合針灸的療效,為DVT臨床治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 SD成年雄性大鼠50只,體質量225～260 g,4～5周齡,在廣東省醫學SD大鼠中心購買。動物許可證號：SYXK(粵)2017-0026,5只大鼠1個籠子,溫度23 ℃左右,濕度要求50%左右,黑夜白晝交替循環,自由進食標準顆粒飼料,飲干凈飲用水。所有實驗動物于開始實驗前,適應環境飼養1 w。動物實驗的實施嚴格遵照《實驗動物護理和使用指南》,試驗嚴格遵守國際疼痛學會使用指南,盡可能減少大鼠的使用量、對大鼠的傷害及導致的痛苦。

1.2藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷〔默克生命科學,高效液相色譜HPLC≥94%,美國化學文摘服務社(CAS)：489-32-7,國藥準字：20150311〕;戊巴比妥鈉(上海上藥新亞,國藥準字：31021724,注射用水稀釋為2% 溶液);Nrf2單抗、HO-1單抗〔艾比瑪特醫藥科技(上海)〕;蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(上海莼試生物);毫針(蘇州神龍針灸醫療,規格：0.30 mm)、華佗牌電針治療儀(上海醫用電子儀器,SDZ-Ⅱ),蛋白電泳儀(北京六一生物 DYCZ-24DH)。

1.3分組及DVT模型建立 大鼠按照隨機數字方法分為Sham組、DVT組、藥物組、針刺組及聯合組,均10只。大鼠均采用0.2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,保持仰臥位及固定,消毒鋪巾,逐層分離腹部皮膚,沿著左下肢股靜脈行走切3.5 cm的皮膚,顯露且游離左側股靜脈,采用(1-0)結扎近心端股靜脈,肉眼可見左下肢腫脹則為建模成功。Sham組不進行結扎,僅做一切口后縫合。

1.4干預方法 建模成功后,藥物組灌胃0.1 ml/kg的淫羊藿苷,連續干預3 w,針刺組根據華興邦制定的實驗動物穴位圖譜取穴,取足三里、脾俞及膈俞。大鼠固定在自制的操作臺上,暴露皮膚后標色定位。采用0.30 mm不銹鋼無菌針針刺所選穴位,連接SDZ-Ⅱ行電針治療儀,采用連續波以局部皮肉輕度顫動為易,留針15 min,每日1次,連續3 w。聯合組治療方法同藥物組和針刺組。Sham組和DVT組均灌胃等體積0.9%生理鹽水。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TXB2及6-Keto-PGF1α水平 干預后大鼠空腹取靜脈血1.2 ml,保存在乙二胺四乙酸(EDTA)管,離心機按照3 000 r/min(半徑10 cm)分離10 min,離心完成后靜置10min,保留上清液保存于-20 ℃冰箱中,采用ELISA檢測TXB2及6-Keto-PGF1α水平。

1.6氧化應激指標檢測 干預后各組取血同上,保留血清采用黃嘌呤氧化酶法檢測各組血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平,采用硫代巴比妥酸(TBA)方法檢測各組血清中丙二醛(MDA),可見光法分析檢測過氧化氫酶(CAT)及比色法方法檢測谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-px)水平。

1.7組織提取及HE染色 2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后,固定于恒溫臺上,心臟穿刺致死,開腹部剝離左側下腔靜脈血管,Bonic液固定血管石蠟包。10%甲醛溶液中,固定過夜,自來水沖洗,浸泡于14% EDTA溶液中脫鈣,逐層脫水后石蠟包埋后4 μm切片后備用。組織切片放入37 ℃復溫15 min,二苯甲脫蠟后按照100%～95%～85%及75%乙醇進行逐層脫水,蘇木素染色10 min,鹽酸(1%)處理,伊紅復染,100%～95%～85%及75%乙醇脫水,封片后觀察組織形態。

1.8TUNEL法檢測各組血管組織內皮細胞凋亡 血管組織與蛋白酶K室溫孵育,切片浸入TUNEL反應液中,后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。過氧化氫沖洗淬滅酶活性,后聯合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯苯胺覆蓋,光學高倍顯微鏡下進行觀察凋亡細胞核呈現棕黃色,隨機選擇5個視野下的細胞觀察凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.9免疫印跡檢測血管組織中Nrf2/HO-1表達 取血管組織50 mg,采用PBS沖洗后切碎,加入1 ml的細胞裂解液,10 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,加入樣孔中,采用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內預冷,然后全部轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脫脂奶粉加入,全程封閉時長1 h。加入1抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000),TBS-吐溫2緩沖液(TTBS)漂洗3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入羊抗兔IgG二抗(1∶2 500),電化學發光(ECL)試劑系統JY-Clear分析蛋白值。

1.10統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組血清中TXB2、6-Keto-PGF1α及TXB2/6-Keto-PGF1α水平比較 與Sham組相比,其余4組血清中TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著升高,6-Keto-PGF1α水平顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯合組及針刺組TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著降低,6-Keto-PGF1α水平顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯合組血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著降低,6-Keto-PGF1α水平顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α及SOD、MDA、CAT、GSH-px水平比較

2.2各組血清中氧化應激SOD、MDA、CAT及GSH-px水平比較 與Sham組相比,其余4組血清中MDA顯著升高,SOD、CAT及GSH-px水平顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯合組及針刺組血清中MDA顯著降低,SOD、CAT及GSH-px水平顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯合組血清中MDA顯著降低,SOD、CAT及GSH-px水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3HE染色檢測各組靜脈血管組織病理改變 Sham組下腔靜脈管腔無明顯擴張,血管腔內無實質性血栓形成,血管靜脈結構及內膜完整,未見壞死內皮細胞;DVT組下腔靜脈內可見大量血栓形成,顏色呈現暗紅色,血管壁組織疏松、水腫及內膜呈現不規則的同時存在大量炎癥細胞浸潤。藥物組及針刺組炎癥細胞減少,血栓減少但血管內膜呈現不規則;聯合組靜脈管腔出現擴張,管腔內血栓減少及未見炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組靜脈血管組織病理改變(HE染色,×200)

2.4TUNEL法檢測各組血管內皮細胞凋亡率比較 與Sham組〔(3.14±0.23)%〕相比,DVT組內皮細胞凋亡率〔(14.25±2.55)%〕顯著升高(P<0.05);與DVT組相比,藥物組及針刺組內皮細胞凋亡率〔分別為(9.25±1.44)%、(8.69±1.50)%〕顯著降低(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯合組內皮細胞凋亡率〔(6.85±1.24)%〕顯著降低(P<0.05),見圖2。

2.5免疫印跡檢測各組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白水平 與Sham組相比,其余4組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯合組及針刺組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯合組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 討 論

DVT疾病常發生在髖關節及膝關節置換術后并常伴隨脊髓損傷,發生率高達80%～100%,且5%的患者合并肺栓塞。DVT形成早期常導致靜脈血栓脫落,其可隨血液循環而達到肺部誘發肺栓塞,升高患者死亡率。DVT疾病形成與機體氧化應激反應存在相關性,DVT發生早期機體存在炎癥損傷,可生存大量ROS,打破了機體氧化-抗氧化平衡,導致血液中存在大量ROS,形成內皮細胞氧化應激損傷而增加內皮細胞凋亡。本研究表示,DVT大鼠氧化應激損傷加劇,通過灌胃淫羊藿苷聯合針刺能夠通過抑制氧化應激而改善內皮細胞凋亡,減少血管內皮損傷,并通過上調血管組織中Nrf2/HO-1活性而發揮作用。

DVT的發生機制與血流緩慢及血管內膜損傷相關,血管內膜損傷可導相關因子異常,共同促進疾病發生發展。前列環素(PGI)2是主要產生于血管內皮細胞并能夠具有抑制血小板聚集抑制血栓形成的因子。TXA2是一種主要由血小板分泌,存在血管收縮及聚集作用因子。在正常生理環境下上述兩種因子可保持動態平衡以維持凝血功能正常,但當上述指標出現極不穩定時能夠轉化成穩定的TXA2/6-Keto-PGF1α而加重血管損傷〔9〕。在中醫學中DVT可歸為“脈痹”或腫脹范疇,根據現在中醫診療規范將其統一稱之為“股腫”,認為其發生機制與瘀、濕及熱相關,臨床治療以益氣活血化瘀為治療根本〔10〕。清代唐宗海《血論證·吐血》中認為淤血不去,新血不生,認為活血化瘀是治療總原則。淫羊藿苷屬于小檗科淫羊藿植物葉中提取的總黃酮的主要活血成分,現代藥理認為其具有增加免疫功能、改善心腦血管功能及調節內分泌等作用〔11〕。淫羊藿在《本草綱目》中被稱為具有“益糟氣,堅筋骨,補腰膝,強心力”之功效。現代理論認為其能夠通過增加血管內皮血流量,改善微循環而減少組織缺氧缺血,發揮血管保護作用〔12〕。DVT疾病血瘀為標本,針刺百會穴能夠振奮周身陽氣達到舒筋通絡而健腦補髓發揮調和氣血等功能,而有利于減少血瘀,發揮減少血栓的作用。周宇博等〔13〕研究表示,采用針刺風池穴、百會穴及雙側風池穴能發揮祛除血瘀而改善腦血管血瘀的作用。本研究說明,淫羊藿苷聯合針刺能夠通過抑制TXA2/6-Keto-PGF1α表達而抑制血管血栓形成。

氧化應激是廣泛存在于生物體內,受到刺激產生的一種防御反應。在創傷、炎癥反應等病理條件下,其氧化應激反應增強的同時導致大量氧化應激因子水平異常,加快血管內皮細胞損傷及凋亡〔14〕。SOD水平升高表示機體總抗氧化能力減弱。SOD屬于一種細胞自由基清除劑,具有促進超氧陰離子發生歧化反應的作用,同時可抑制MDA等氧化因子的表達,具有內皮細胞修復和穩定的作用。DVT發生后可存在大量ROS及羥自由基生成,CAT及GSH-ps降低,MDA表達升高是脂質過氧化物的終產物,能夠參與機體氧化系統失衡,較好反應血管內皮過氧化損傷程度〔15〕。以往研究證實,淫羊藿苷能夠較好改善微血管心肌缺血,還能通過改善血管氧化應激而增加內皮細胞活性〔16〕。淫羊藿苷是淫羊蕾的主要成分,屬于補腎溫陽藥物,具有抗氧化應激損傷及保護內皮細胞的作用。胡彥武〔17〕研究表示,淫羊藿苷能夠減少半胱氨酸(Hcy)誘導的血管損傷,主要通過抑制MDA表達、增加SOD水平,進一步減少血管內皮細胞凋亡而發揮抗血栓作用。針刺具有抗氧化應激、調節自由基而發揮抑制細胞凋亡的作用。針刺的抗氧化作用通過調節體內自由基動態平衡,從而發揮抑制內皮細胞損傷等作用。在卵巢細胞中,磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是細胞活性調節因子,針刺能夠調節信號通路,調節細胞凋亡機制。本研究說明,淫羊藿苷聯合針刺可通過抑制氧化損傷而改善血管內皮細胞凋亡。

在氧化應激反應過程中Nrf2/HO-1活性失活,其表達升高后能夠抑制由糖代謝異常導致的氧化損傷,DVT發生過程中炎癥因子被激活可促進巨噬細胞活性并聚集,進而形成斑塊阻塞血管〔18〕。在DVT小鼠模型中激活Nrf2可增加下游Ⅱ相酶表達,減少低密度脂蛋白介導的巨噬細胞聚集,減少血管內泡沫細胞形成,減少血栓形成。HO-1是Nrf2信號的下游靶基因,兩者結合后能夠抑制DVT中斑塊形成,結合以往研究證實抑制血管氧化損傷能夠上調Nrf2/HO-1表達并與減少血管損傷相關〔19〕。淫羊藿苷可通過激活Nrf2水平而發揮抗氧化作用,能夠減少炎癥反應而發揮血管保護作用。針灸具有調節微循環而發揮抗炎及抗氧化應激功能,其被認為在創傷性腦出血大鼠中能夠通過抗氧化作用激活Nrf2/HO-1表達,而發揮腦血管保護作用。陳明霞等〔20〕研究表示,淫羊藿苷劑量依賴性地通過激活Nrf2/HO-1/醌氧化還原酶(NQO)1信號通路改善缺血再灌注引起的大鼠腎損傷。潘亮等〔21〕研究表示,銀杏達莫聯合針灸通過上調Nrf2/HO-1通路活性改善大鼠創傷性腦出血后神經功能,這與抑制氧化應激損傷相關。本研究結果表明,淫羊藿苷聯合針刺可激活Nrf2/HO-1抗氧化損傷,發揮血管保護作用。

綜上,淫羊藿苷聯合針灸能夠通過抑制TXB2/6-Keto-PGF1α及氧化應激水平改善血管內皮損傷,與激活Nrf2/HO-1信號通路相關。本文仍存在一定不足之外,未進行細胞有關試驗及樣本量較少,實驗內容單一,今后應擴大樣本量充實實驗內容,為相關研究提供有利依據。