擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)在染色體拷貝數(shù)變異檢測中的臨床應用效果評價

馮 暄 張慶華 王 興 何 靜 梁濟慈 賈春暘 藺朋武 朱韶華 郝勝菊

（甘肅省醫(yī)學遺傳中心 甘肅省出生缺陷與罕見病臨床研究中心 甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

目前，利用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)檢測胎兒染色體非整倍體異常已成為臨床產(chǎn)前篩查的重要方法。1997年，LO等[1]首次報道在孕婦血液中含有胎兒游離DNA（cell-free fatal DNA，cffDNA）片段，使得基于cffDNA篩查胎兒染色體非整倍體成為可能。隨著測序技術(shù)的進一步發(fā)展，檢測染色體微缺失/微重復的擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)（expanded non-invasive prenatal testing，NIPT-plus）被引入新生兒篩查實驗室[2]。染色體的微缺失/微重復又稱為拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），其臨床發(fā)生率為1.6%～1.7%，高于唐氏綜合征，且與孕婦年齡無關(guān)，可導致染色體微缺失/微重復綜合征（<5 Mb），可能造成患兒身體不同程度殘疾、生長發(fā)育遲緩或智力受損等，患兒可長期存活，且大多有生育能力[3]。在全部出生缺陷中，約有19%的先天性缺陷是由染色體異常導致的，其中CNV是重要的致病因素[4]。由于染色體微陳列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測成本較高，大部分患者僅選擇傳統(tǒng)的羊水核型分析，造成大量攜帶CNV的胎兒漏檢。因此，評估NIPT-plus篩查染色體微缺失/微重復的臨床效能具有重要的意義。本研究擬對NIPT-plus篩查高風險的孕婦采用介入性產(chǎn)前診斷[低深度全基因組測序（copy number variation sequencing，CNVseq）和染色體核型分析]確診，以明確NIPT-plus的檢測效能，探討NIPT-plus在篩查胎兒染色體微缺失/微重復中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017—2018年在甘肅省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心進行NIPT-plus檢測的孕婦10 187例，年齡（31.71±5.0）歲，孕周（18.0±3.6）周。納入標準：1）血清學產(chǎn)前篩查示21-三體綜合征、18-三體綜合征高風險或臨界風險；2）高齡妊娠（預產(chǎn)年齡≥35歲）；3）B超軟指標異常；4）錯過唐氏綜合征篩查（簡稱唐篩）檢測時間；5）因其他原因要求行NIPT。排除標準：1）雙胎或多胎妊娠；2）1年內(nèi)接受過異體輸血；3）1年內(nèi)接受過免疫治療、移植手術(shù)、干細胞治療；4）孕期患有實體腫瘤；5）采血當日體重>100 kg。本研究通過甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準（2018院倫審研第30號），所有研究對象均知情同意，NIPT結(jié)果提示高風險的孕婦進行遺傳咨詢并告知相關(guān)風險后簽署侵入性產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

血漿游離DNA提取試劑盒（磁珠法）、高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒和無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒均購自杭州貝瑞和康公司。文庫定量檢測試劑盒（美國KAPA公司），T100 PCR儀（美國伯樂公司），Stepone plus熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司），NextSeq CN500高通量測序儀（美國Illumina公司）。

1.2.2 NIPT-plus檢測

采集所有研究對象外周血10 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用兩步離心法去除殘余白細胞和細胞碎片。采用血漿游離DNA提取試劑盒提取cffDNA，cffDNA濃度應>3%。通過DNA末端修復、通用測序引物和樣本識別標簽連接、文庫構(gòu)建產(chǎn)物純化的方法進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建后的文庫濃度>0.2 ng/mg。將混合的文庫在NextSeq CN500高通量測序平臺上進行測序，測序數(shù)據(jù)與人類參考基因組hg19序列進行比對，根據(jù)RUPA快速分析流程（杭州貝瑞和康公司），檢測胎兒染色體CNV。

1.2.3 羊水采集和染色體核型分析

在B超引導下行羊膜腔穿刺術(shù)，羊水樣本送細胞遺傳實驗室，按標準操作方法和步驟進行細胞培養(yǎng)，采用原位收獲法收獲染色體，G顯帶，在顯微鏡下進行染色體核型分析。

1.2.4 羊水CNV-seq檢測

按照樣本DNA提取試劑盒的標準操作流程提取羊水樣本DNA，對獲得的DNA進行純化。按照染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒的標準操作流程，打斷DNA，末端修復，加入polyA和特定接頭，純化。采用NextSeq CN500 高通量測序儀對純化、質(zhì)檢后的DNA文庫進行測序。采用科諾安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對測序數(shù)據(jù)進行序列比對和分析，獲得目標染色體的Z值和全部>100 kb 的染色體拷貝數(shù)變異。

1.2.5 外周血CNV-seq檢測

采集所有NIPT-plus高風險孕婦的靜脈血，進行CNV-seq檢測（檢測方法同羊水CNVseq），以驗證是否為母體CNV異常導致NIPTplus結(jié)果假陽性。

1.2.6 生物信息學分析

測序所得的讀長與人類參考基因組hgl9序列進行比對。通過檢索Decipher數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PubMed數(shù)據(jù)庫和UCSC基因組瀏覽器、Clinvar數(shù)據(jù)庫，對檢測到的CNV的致病性進行評估。參照美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南，將檢出的CNV分為5個級別：明確致病性、可能致病性、臨床意義未明、良性、可能良性。

1.2.7 隨訪

采用電話隨訪方式對所有受檢孕婦隨訪至分娩后3個月，隨訪內(nèi)容包括產(chǎn)前診斷情況、孕期產(chǎn)檢監(jiān)測結(jié)果、妊娠結(jié)局和新生兒出生缺陷情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用線性相關(guān)分析評估CNV發(fā)生與孕婦年齡的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 10 187例孕婦一般資料分析

10 187例孕婦中，有76例（0.75%）因血漿cffDNA濃度不達標而重新采樣。采用NIPTplus從10 187例孕婦中篩查出高風險孕婦164例（1.61%），其余10 023例孕婦為NIPT-plus低風險。10 187例孕婦一般資料和NIPT-plus高風險孕婦分布見表1。

表1 10 187例孕婦一般資料和NIPT-plus高風險孕婦分布

2.2 NIPT-plus高風險孕婦篩查結(jié)果

164例NIPT-plus高風險孕婦中，21-三體綜合征高風險32例、18-三體綜合征高風險11例、13-三體綜合征高風險9例、47，XXX高風險14例、47，XXY高風險10例、47，XYY高風險5例、45，XO高風險47例、CNV高風險33例。

2.3 NIPT-plus高風險孕婦羊水樣本CNV-seq檢測結(jié)果

164例NIPT-plus高風險孕婦中，有131例接受CNV-seq檢測，共確診59例，假陽性72例（0.71%，72/10 187）。NIPT-plus篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的陽性預測值分別為91.67%、71.43%、25.00%，篩查性染色體非整倍體異常和CNV的陽性預測值分別為27.87%、39.40%。見表2。

表2 164例NIPT-plus高風險孕婦CNV-seq檢測結(jié)果

2.4 NIPT-plus對CNV的檢出率

164例NIPT-plus高風險孕婦中，胎兒染色體CNV異常33例，CNV-seq確診13例，假陽性15例，其中有5例（病例1、12、13、17、22）由于母體CNV異常而導致假陽性。33例胎兒染色體CNV異常孕婦診斷結(jié)果見表3。

表3 33例胎兒染色體CNV異常孕婦診斷結(jié)果

2.5 NIPT-plus檢測染色體非整倍體異常和CNV的性能

NIPT-plus篩查胎兒21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征的陽性預測值分別為91.67%、71.43%和25.00%，特異性分別為99.98%、99.98%、99.94%，敏感性均為100.00%。

對于性染色體非整倍體異常，NIPT-plus篩查超雄綜合征（47，XXY）的陽性預測值、敏感性和特異性均為100.00%；篩查超雌綜合征（47，XXX）和克氏綜合征（47，XXY）的陽性預測值均為44.44%，敏感性為100.00%，特異性為99.95%；篩查特納綜合征的陽性預測值最低（12.50%），假陽性率為0.34%，敏感性為100.00%，特異性為99.66%。對于染色體拷貝數(shù)變異，NIPT-plus篩查5～10 Mb缺失/重復的陽性預測值、敏感性和特異性均為100.00%；篩查>10 Mb的缺失/重復的陽性預測值為62.50%，敏感性為100.00%，特異性為99.97%；篩查<5 Mb的缺失/重復的陽性預測值為42.86%，敏感性為90.00%，特異性為99.88%。見表4。

表4 NIPT-plus檢測CNV的性能

2.6 NIPT-plus篩查不同年齡孕婦CNV的效能

CNV的發(fā)生與孕婦年齡無線性關(guān)系（P>0.05）。孕婦年齡對NIPT-plus篩查CNV的陽性預測值、特異性、敏感性均無影響。見表5。

表5 NIPT-plus篩查不同年齡孕婦CNV的效能

2.7 隨訪結(jié)果

2.7.1 NIPT-plus高風險和低風險孕婦隨訪結(jié)果

10 023例NIPT-plus低風險孕婦中，成功完成隨訪8 810例，隨訪有效率為87.9%，其中8 685例孕婦順利分娩，新生兒各項體檢指標均正常；另125例因后期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒畸形或因死胎而引產(chǎn)。164例NIPT-plus高風險孕婦中，有131例行產(chǎn)前診斷，最終確診陽性59例，其中11例分娩（5例確診為胎兒性染色體非整倍體異常、6例確診為胎兒CNV異常）后，新生兒未發(fā)現(xiàn)無明顯異常；4例確診為胎兒性染色體非整倍體異常的孕婦發(fā)生孕中期流產(chǎn)；其余44例陽性孕婦均選擇終止妊娠。

2.7.2 拒絕或未行介入性產(chǎn)前診斷孕婦的隨訪結(jié)果

164例NIPT-plus高風險孕婦中，有33例拒絕或未行介入性產(chǎn)前診斷。隨訪結(jié)果顯示，13例提示21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征高風險孕婦中，有4例自然流產(chǎn)，5例直接引產(chǎn)，4例拒絕隨訪；15例提示性染色體非整倍體異常高風險的孕婦中，有9例繼續(xù)妊娠，分娩后新生兒未行染色體核型分析，家屬自述未見明顯異常，2例直接引產(chǎn)，4例拒絕隨訪；5例提示CNV異常高風險的孕婦中，有1例NIPT-plus結(jié)果與孕婦本人染色體結(jié)果一致，繼續(xù)妊娠，分娩后新生兒無明顯異常，1例直接引產(chǎn)，3例拒絕隨訪。

3 討論

近年來，隨著遺傳學檢測技術(shù)水平的不斷提高和人類基因組數(shù)據(jù)庫信息的不斷更新和完善，染色體CNV的臨床意義得以被證實。NIPT憑借其高陽性預測值、高敏感性和高特異性等優(yōu)勢，已成為篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的常規(guī)技術(shù)。除了染色體數(shù)目異常之外，致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variant，pCNV）也是出生缺陷重要的遺傳學因素。有研究結(jié)果顯示，胎兒攜帶pCNV的比例可高達1.6%～1.7%，遠高于21-三體綜合征（0.5%～0.6%）[5-6]。因此，開展無創(chuàng)pCNV篩查對預防出生缺陷有重要意義。

除21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征外，NIPT-plus還可篩查出其他常染色體異常、性染色體異常和pCNV的高風險孕婦[2，7-8]。有研究結(jié)果顯示，對于片段>6 Mb的pCNV，NIPT-plus的篩查效率可達83.0%～90.9%[9-10]，且隨著cffDNA濃度的富集、測序深度的增加和生物信息學分析流程的進一步優(yōu)化，對如DiGeorge綜合征等3 Mb左右小片段的pCNV的篩查陽性預測值可達92.9%[2]。美國醫(yī)學遺傳學會、國際產(chǎn)前診斷協(xié)會均指出，在做好知情同意，明確待檢測pCNV的檢出率、特異性、陽性預測值、陰性預測值等指標的前提下，可以針對臨床意義明確、表型嚴重的pCNV進行篩查[11-12]。雖然美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會關(guān)于篩查胎兒染色體異常的臨床聲明因臨床驗證數(shù)據(jù)不充分而暫不推薦開展pCNV篩查，但同時指出，如果NIPT-plus發(fā)現(xiàn)pCNV，應進行后續(xù)驗證[13]。因此，在臨床前期實驗數(shù)據(jù)充分、各項關(guān)鍵指標明確的前提下，對發(fā)病率高、致病性嚴重的pCNV可采用NIPT-plus篩查。

目前，NIPT-plus已有多個技術(shù)平臺，各個技術(shù)平臺的測序原理不一致，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也不一致，篩查結(jié)果會出現(xiàn)一定的差異。另外，相同的技術(shù)平臺，如參考的人類基因組序列版本不一致也會得出不一致的結(jié)果。本研究采用NextCN500高通量測序平臺，測序深度為0.2×～0.3×，每份樣本的數(shù)據(jù)量為18 Mb左右，唯一比對序列≥10 Mb。將該平臺檢出的CNV按發(fā)生的大小可分為<5 Mb、5～10 Mb、>10 Mb共3個類別，其陽性預測值分別為42.86%、100.00%、62.50%，總陽性預測值為68.50%，對<5 Mb的CNV檢測性能最低。有學者報道了一種使用350萬Reads識別71.8%的CNV的方法，發(fā)現(xiàn)當CNV<5 Mb時，檢測性能會下降至41.2%[14]。LO等[9]使用400～600萬Reads分析3～42 Mb的CNV，準確率為64.5%。SRINIVASAN等[15]的研究結(jié)果顯示，測序深度越深、cffDNA濃度越高，可檢測到的畸變片段越小。由此可見，測序深度的降低在一定程度上限制了對小片段CNV的檢出。

本研究結(jié)果顯示，NIPT-plus共篩查出CNV高風險孕婦33例，其中有5例拒絕羊水穿刺，有28例行羊水穿刺和外周血檢測，采用CNVseq確診。該28例孕婦中，有15例經(jīng)CNV-seq驗證為假陽性，其中5例（33.3%）CNV來源于母體，是由母體CNV導致的假陽性。由此可見，母體CNV異常是NIPT-plus檢測假陽性的一個重要原因。本研究通過CNV-seq檢測共確診13例，經(jīng)父母來源驗證，結(jié)果顯示2、3、5、7、8、9號樣本的變異均來自父母一方，該6例孕婦經(jīng)遺傳咨詢后選擇繼續(xù)妊娠，常規(guī)產(chǎn)檢。本研究13例陽性樣本中，有7例（53.8%）CNV變異證實為新發(fā)變異，依據(jù)ACMG指南進行致病性分析，確定均為致病性變異，其中1例診斷為DiGeorge綜合征，另6例均為>5 Mb的變異，可導致臨床表型異常，如嚴重的畸形或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。因此，這7例孕婦均選擇終止妊娠。由于NIPT-plus檢測的是來源于胎盤的游離DNA，受疾病發(fā)生率、假陽性率、cffDNA濃度、測序深度、微缺失/微重復片段大小等多種因素的影響[14-16]，NIPT-plus可篩查出>3 Mb的CNV，但仍有很多pCNV不能被有效檢出[2]，需要在檢測前充分告知。同時，NIPT-plus也可篩查出大量臨床意義未明的CNV[17]或?qū)μ河绊懖粐乐氐膒CNV，這類CNV均不建議納入篩查報告[18]。CNV所致的疾病大多屬于新發(fā)突變導致的零散發(fā)病，建議結(jié)合CNV大小、致病性、疾病嚴重程度、是否外顯不全等情況進行綜合分析，否則可能會導致孕婦不必要的孕期焦慮，同時增加診斷負擔，為產(chǎn)前遺傳咨詢帶來困擾。

綜上所述，NIPT-plus可用于染色體非整倍體、染色體微缺失/微重復、性染色體異常等的篩查，彌補了染色體核型分析的不足。未來應進一步提高NIPT-plus在檢測染色體微缺失/微重復中的特異性、準確性和敏感性。