巢式多重聚合酶鏈反應快速診斷兒童腦膜炎/腦炎

石迎迎 潘 芬 孫 燕 王 春 蔣 婕 于方圓 張天棟 秦惠宏 張 泓

（上海市兒童醫院 上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040）

腦膜炎/腦炎是發病迅速、病情進展快、致死率高的臨床急癥[1]。進展快速的細菌性腦膜炎24～48 h即可致命[2]。有多種原因可誘發腦膜炎/腦炎，包括感染性和非感染性因素。中樞神經系統感染通常由細菌、病毒或真菌引起，其中最常見的是病毒性腦炎。兒童病毒性腦炎發病率約為16/10萬，顯著高于成人[3]。中國疾病預防控制中心流行病學調查數據顯示，5歲以下兒童細菌性腦膜炎總體發病率顯著高于成人[4]。因此，兒童腦膜炎/腦炎的快速診斷具有極其重要的意義。腦脊液培養是鑒別細菌和非細菌性腦炎/腦膜炎的常規方法[5]，也是診斷疾病的金標準，但其病原體檢出率偏低，檢測周期較長，易受多種因素影響[6]。由于病毒培養的特殊性，臨床對病毒性腦膜炎/腦炎的診斷主要依靠實驗室數據，但常規方法敏感性和特異性均不理想。尋找高特異性和高敏感性的中樞神經系統感染病原體檢測新方法迫在眉睫。

巢式多重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）可在1 h內同時檢測多種病原體，包括病毒、細菌和真菌，樣本用量少，敏感性和特異性高[7]。本研究擬采用巢式多重PCR檢測中樞神經系統感染患兒腦脊液樣本，分析這種快速病原體檢測方法在兒童腦膜炎/腦炎診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2017年5月—2020年5月上海市兒童醫院神經內科、新生兒科、重癥醫學科、血液科、消化與感染科臨床診斷為中樞神經系統感染或疑似中樞神經系統感染患兒的腦脊液樣本82例，所有患兒年齡均<18歲，診療記錄完整。中樞神經系統感染或疑似中樞神經系統感染診斷標準參考文獻[8-9]。排除標準：1）患兒有先天性疾病或慢性疾病；2）患兒在腦脊液樣本采集時已有其他無法排除的中樞神經系統疾病；3）腦脊液樣本量低于檢測要求。本研究經上海市兒童醫院倫理委員會審查批準（2019R031-F01），所有患兒監護人均知情同意。

1.2 方法

收集所有患兒腦脊液常規和生化檢測結果（腦脊液白細胞計數、葡萄糖、蛋白、氯、乳酸脫氫酶）、腦脊液培養結果和本次住院天數、抗菌藥物使用天數、是否使用阿昔洛韋、是否合并感染、是否發熱和臨床結局等臨床資料。采用法國生物梅里埃公司Filmarray2.0多重核酸檢測系統及配套ME panel檢測14種病原體，包括大腸埃希菌K1株、流感嗜血桿菌、單核細胞增生性李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、新生隱球菌/格特隱球菌、巨細胞病毒、腸道病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人皰疹病毒6型、人雙埃可病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。嚴格按說明書要求進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計數資料用例或率表示，組間比較采用Fishers精確檢驗。正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。偏態分布計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示。以P<0.05為差異有統計學 意義。

2 結果

2.1 82例患兒基本臨床資料

82例患兒中，男49例、女33例，年齡（3.52±3.95）歲。臨床診斷為細菌性中樞神經系統感染30例，病毒性中樞神經系統感染23例，疑似中樞神經系統感染29例；好轉76例，未愈4例，死亡2例。具體情況見表1。

表1 82例患兒基本臨床資料

2.2 巢式多重PCR檢測結果

82例患兒中，臨床明確診斷53例，其中巢式多重PCR檢出31例（58.5%）陽性病例；30例臨床明確診斷為細菌性中樞神經系統感染的患兒中，巢式多重PCR僅檢出11例（36.7%）細菌陽性；23例臨床明確診斷為病毒性中樞神經系統感染的患兒中，巢式多重PCR檢出20例（87.0%）病毒陽性；巢式多重PCR病毒陽性檢出率顯著高于細菌陽性檢出率（P<0.05）。病毒陽性患兒中，腸道病毒感染率最高；細菌陽性患兒中，無乳鏈球菌感染率最高。1～12個月、3～6歲患兒病毒感染率最高，<1個月患兒細菌感染率最高。見圖1。

圖1 巢式多重PCR病原體檢出情況

2.3 不同類型病原體感染患兒相關指標比較

細菌組腦脊液白細胞計數、蛋白水平、乳酸脫氫酶水平、抗菌藥物使用天數和住院天數均高于病毒組，腦脊液葡萄糖水平和阿昔洛韋使用率均低于病毒組（P<0.05）。腦脊液中氯含量2個組差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 病毒組、細菌組相關指標比較

2.4 巢式多重PCR與培養法、實驗室指標判斷結果比較

巢式多重PCR與培養法判斷細菌性腦膜炎/腦炎的一致性較好（Kappa=0.659，P<0.001），見表3。2種方法具體細菌種類檢出情況見表4。

表3 巢式多重PCR與培養法一致性分析 例

表4 巢式多重PCR與培養法細菌鑒定結果 株

巢式多重PCR與實驗室指標判斷病毒性腦膜炎/腦炎的一致性分析較好（Kappa=0.737，P<0.001）。見表5。

表5 巢式多重PCR與實驗室指標判斷的一致性分析 例

3 討論

目前，我國最常見的細菌性腦膜炎病原菌是肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、大腸埃希菌，3月齡內兒童細菌性腦膜炎主要病原菌為無乳鏈球菌和大腸埃希菌[10]。本研究中，細菌陽性患兒無乳鏈球菌感染率最高，且多為<1個月患兒。巢式多重PCR細菌檢出率低的原因是其檢測細菌的覆蓋范圍有限，特異性高說明其準確性高，假陽性率低，可以準確檢出檢測系統覆蓋的病原體。有研究發現，我國病毒性腦炎或腦膜炎最常見的病毒病原體為腸道病毒[11]，與本研究腸道病毒檢出率最高的結果一致，也與浙江省疾病預防控制中心的調查結果相似[12]。

對于疑似細菌性腦膜炎患兒，一般推薦入院后1 h內即使用抗菌藥物，并推薦將三代頭孢菌素作為初始經驗治療用藥方案之一[13]。本研究檢出1例單核細胞增生性李斯特菌感染患兒，該菌對頭孢菌素類抗菌藥物天然耐藥[14]，提示快速多重分子檢測能夠減少經驗性抗菌藥物的不當使用。病毒性腦膜炎/腦炎患兒中，單純皰疹病毒腦炎患兒一般預后最差，未經治療患兒病死率為70%～80%，即使進行特定的抗病毒治療，病死率仍高達30%[15]。因此，兒童病毒性中樞神經系統感染需要早診斷，及時進行有效干預[16]。快速的分子診斷方法能夠快速鑒定病原體，有效避免患兒不良預后，縮短住院時間[17]。對于病原不明的病毒性腦炎或疑似單純皰疹病毒性腦炎，在沒有明確的病原學檢查結果的情況下，推薦先使用阿昔洛韋治療[18]。兒童中樞神經系統病毒感染需要早期診斷，并及時采取有效的干預，但據報道，仍有近50%的病毒性腦炎患兒因無法獲得明確的病原學結果而延誤治療[19]。本研究發現，腸道病毒陽性患兒阿昔洛韋使用率達70.00%（7/10），總體來說，病毒組阿昔洛韋使用率為60.87%，細菌組僅為10.00%。因此，快速多重分子檢測技術的應用迫在眉睫，可短時間內幫助臨床判斷病毒感染情況，從而對癥治療，減少阿昔洛韋經驗性使用。

腦脊液實驗室檢測是目前輔助診斷兒童中樞神經系統感染的必要依據，腸道病毒、人皰疹病毒6型等導致的中樞神經系統感染患者腦脊液白細胞計數不升高[20]，但也有部分細菌性腦膜炎患者腦脊液白細胞計數不升高的報道[21]。本研究共檢出7例根據實驗室指標判斷為陰性的樣本，均為病毒感染，這一結果表明，如果單純采用腦脊液實驗室指標判斷兒童中樞神經系統感染，有漏診或誤診風險。

然而，本研究結果顯示，巢式多重PCR陰性樣本中，有2例培養出細菌，其病原體種類不在檢測系統覆蓋范圍內。提示巢式多重PCR檢測仍有一定的局限性，需要進一步優化。建議聯合送檢快速多重分子檢測和腦脊液培養，并結合其他輔助檢查，以更大程度發揮快速多重分子檢測的診斷價值[22]。

綜上所述，巢式多重PCR具有快速，操作簡便，結果可靠，可同步檢出多種病原體的優勢，可彌補傳統病原學檢測方法的不足，值得在臨床推廣。