上海地區9種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盲樣檢測結果一致性分析

楊 雪 朱 俊 蔣玲麗 王 青 胡曉波

（上海市臨床檢驗中心，上海 100126）

新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）為β屬冠狀病毒，有包膜，形狀為圓形或橢圓形，是單股正鏈RNA病毒。實驗室檢測包括抗原檢測和核酸檢測。核酸檢測具有較高的靈敏度和特異性，是診斷SARS-CoV-2感染的“金標準”。SARS-CoV-2核酸檢測主要針對病毒的OFR1ab基因（編碼RNA聚合酶，可參與病毒核酸復制）、N基因（編碼核殼蛋白，與病毒基因組宿主RNA相互識別）和E基因（編碼囊膜蛋白，與病毒包膜和病毒顆粒形成有關）。

SARS-CoV-2核酸檢測結果的假陽性和假陰性一直備受關注[1-2]。造成結果假陽性/假陰性的原因可能是樣本采集、運輸過程中的不恰當處理，也可能是實驗室內部不規范的操作。循環閾值（cycle threshold，Ct）是判斷檢測結果的重要標準。本研究對上海市臨床檢驗中心組織的全市SARS-CoV-2核酸檢測實驗室4次盲樣檢測結果進行分析，重點分析不同品牌SARSCoV-2核酸檢測試劑檢測結果Ct值的一致性和不同品牌檢測試劑的檢測性能，旨在及時掌握上海市SARS-CoV-2核酸檢測質量，以確保類似場景下臨床實驗室能夠快速反應，且檢測結果一致、可靠。

1 材料和方法

1.1 盲樣樣品

盲樣樣品為經處理的SARS-CoV-2 RNA（含胍鹽）樣本，600 μL/支，每套5支，包括陰性樣品2支和陽性樣品3支。陽性樣品濃度分別為1.00×103拷貝/mL（濃度1）、1.75×103拷貝/mL（濃度2）和3.5×103拷貝/mL（濃度3）；2支陰性樣品為樣本保存液稀釋的體外培養人體細胞。

1.2 樣品發放和檢測

每周將盲樣通過冷鏈隨機發放至上海市所屬SARS-CoV-2核酸檢測實驗室：第1次發放至230個實驗室，第2次發放至233個實驗室，第3次發放至234個實驗室，第4次發放至230個實驗室，合計927套。實驗室在規定時間內按要求儲存、復融、混勻、離心、檢測，并上傳檢測結果。

1.3 檢測試劑

盲樣共涉及9種SARS-CoV-2核酸檢測試劑，分別編號為A、B、C、D、E、F、G、H、I。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。分析盲樣檢測結果與預期結果的一致性，計算陽性樣品ORF1ab基因和N基因Ct值的x、中位數（M）、95%可信區間（confidence interval，CI）、極差（R）和變異系數（coefficient of variation，CV），根據拉依達準則（3σ準則）剔除離群值。由于D和G試劑結果判讀時各有10和5個Ct值不計數，因此在結果比較時分別加10個和5個Ct值進行校準。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗對9種試劑的檢測結果進行組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 參評實驗室基本情況

參與4次盲樣檢查的實驗室共249個，其中公立醫療機構實驗室108個，社會辦醫療機構實驗室6個，醫學檢驗實驗室132個，其他類型實驗室3個。

2.2 9種試劑基本情況

9種試劑均采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）對靶基因進行檢測。有2種試劑（C和G）檢測靶基因為ORF1ab、N和E基因，其余7種試劑檢測靶基因均為ORF1ab和N基因。9種試劑檢出限為200～500拷貝/mL。見表1。

2.3 參評實驗室檢測結果總體情況

249個實驗室均檢出3個陽性盲樣的全部靶基因，檢出率均為100%，2個陰性盲樣檢測符合率均為100%。3個陽性盲樣ORF1ab基因檢測Ct值的CV分別為4.32%（濃度1）、4.42%（濃度2）、4.43%（濃度3）；N基因檢測Ct值的CV分別為4.32%（濃度1）、4.46%（濃度2）、4.54%（濃度3）；ORF1ab基因和N基因Ct值的極差（R）值分別為8.15和7.73（濃度1）、8.07和7.71（濃度2）、7.98和7.52（濃度3）。各實驗 室檢測結果Ct值見圖1。

圖1 3個濃度陽性盲樣ORF1ab基因和N基因Ct值分布

2.4 9種試劑Ct值波動情況

3個濃度陽性盲樣9種試劑間ORF1ab基因和N基因Ct值的差異范圍分別為2.58～2.66和2.88～3.06。9種試劑3個濃度陽性盲樣ORF1ab基因和N基因Ct值比較，差異均有統計學意義（P<0.001）。不同試劑組兩兩比較結果顯示，D試劑ORF1ab基因和N基因檢測結果與其他8種試劑差異有統計學意義。經Bonferroni校正后，D試劑與A、B、C、H、I、F、G試劑比較，ORF1ab基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統計學意義（P<0.05），D試劑與A、B、C、E、F、G、H、I試劑比較，N基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統計學意義（P<0.05）。A試劑和H試劑ORF1ab基因檢測結果差異無統計學意義（P>0.05），A試劑和H試劑與其他8種試劑比較，ORF1ab基因檢測結果差異均有統計學意義。經Bonferroni校正后，A試劑與B、C、D、E、F、G、I試劑比較，H試劑與B、C、D、E、G、I試劑比較，ORF1ab基因濃度1、濃度2和濃度3差異均有統計學意義（P<0.05）。D試劑的ORF1ab基因和N基因檢測結果Ct值較高，A試劑和H試劑ORF1ab基因檢測結果Ct值較低。

9種試劑組內ORF1ab基因和N基因Ct值極差（R）的差異范圍分別為4.37～7.94和4.11～7.21。A、B、C、E、F和I這6種試劑組內實驗室間ORF1ab基因和N基因Ct值的CV均<5%。D試劑組內ORF1ab基因檢測結果極差（R）和CV均較大。見表2、表3。

表2 9種試劑3個濃度陽性盲樣ORF1ab基因Ct值波動情況

表3 9種試劑3個濃度陽性盲樣N基因Ct值波動情況

3 討論

2022年3月末，上海地區新型冠狀病毒肺炎疫情暴發，上海地區SARS-CoV-2核酸檢測量與日俱增，屢創新高。為確保實驗室檢測結果正確、可靠，上海市臨床檢驗中心通過盲樣方式開展室間質量評價，同時將檢查頻次從每月1次增加為每周1次。4次SARS-CoV-2盲樣檢查結果顯示，上海地區SARS-CoV-2核酸檢測實驗室主要使用9種檢測試劑，均采用RT-PCR方法，最低檢出限均能達到500 拷貝/mL，符合《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[3]工作要求。2種陰性樣品和3種陽性樣品的盲樣檢測結果的正確率均為100%，說明實驗室SARS-CoV-2核酸檢測能力可滿足防疫要求。

基于SARS-CoV-2核酸檢測結果的不同用途（篩查、療效監測、出院或出艙判斷），實驗室除按試劑盒說明書要求報告陽性和陰性結果外，必要時還需同時上報陽性結果Ct值。Ct值的高低對應不同的病毒載量。有研究結果顯示，Ct值每增加3，病毒載量降低1個數量級，Ct值分別為12和33時，對應的病毒載量分別為2.2×106pfu/mL和15 pfu/mL[4]。本研究中使用了3個濃度陽性盲樣，每個濃度盲樣ORF1ab基因和N基因實驗室檢測結果Ct值的CV均<5%，但R值可達8。不同實驗室檢測結果Ct值差異大提示應先對SARS-CoV-2核酸檢測結果進行標準化和一致化的管理，再將結果用于臨床病毒載量的判斷。各濃度盲樣N基因的Ct值均低于ORF1ab基因，與臨床實際檢測結果相符，原因可能為SARSCoV-2核酸在轉錄時會形成不同長度的mRNA片段，這些片段中均含有N基因，只有少數mRNA片段含ORF1ab基因。

本研究結果顯示，9種試劑同一濃度盲樣檢測結果Ct值存在一定差異。9種試劑檢測3個濃度陽性盲樣時，ORF1ab基因和N基因Ct值的差異范圍分別為2.58～2.66和2.88～3.06。原因可能是不同試劑引物和探針設計原理和對靶基因的檢測能力存在一定差異[5]。有研究結果顯示，核酸檢測試劑盒的批間差異較大，這個問題應引起重視[6-8]。本研究9種試劑說明書中對不精密度的要求是5%，以此為標準，A、B、C、E、F和I這6種試劑組內實驗室間ORF1ab基因和N基因Ct值的CV均滿足要求，但不同檢測試劑組內ORF1ab基因和N基因Ct值仍存在較大差異，R值差異范圍分別為4.37～7.94和4.11～7.21。原因可能是核酸提取方式、檢測系統的分析性能差異、擴增儀器差異、定量閾值限設置不同[9]。有研究結果顯示，SARS-Cov-2核酸檢測假陽性結果主要出現在濃度較低的樣本中[10]。因此，建議實驗室在更換試劑批號時，對試劑批間差進行驗證，尤其應關注弱陽性樣本的檢測結果。

SARS-CoV-2核酸檢測結果出現假陽性/假陰性時，除應關注檢驗過程中的因素外，還應關注檢驗前階段樣本質量問題。樣本采集方法、采集部位、采樣管、樣本量、運輸時間、感染后樣本采集時機等檢驗前環節都會影響樣本病毒載量，進而影響Ct值[4]。當病毒載量較高（Ct值較小）時，陽性結果易被檢出。假陰性結果易出現在樣本病毒載量較低時，此時需使用弱陽性樣品來監測實驗室檢測能力。不同SARSCoV-2核酸檢測試劑的效能不同，尤其對弱陽性樣本而言，檢測結果差異更加明顯[11]。弱陽性樣本濃度一般為試劑檢出限的1.5～3.0倍，本研究中僅濃度1（標準值為1.00×103拷貝/mL）盲樣對檢出限為500、350和300 拷貝/mL的試劑而言滿足要求，這也是9種試劑陽性檢出率較高的原因。為加強實驗室對弱陽性樣本的檢驗能力，后期盲樣設計中應準備更低濃度的樣品。本研究使用的盲樣未能監控到檢驗前環節，結果僅能說明實驗室內的檢測能力。

Ct值與SARS-CoV-2病毒載量密切相關，病毒載量越大，Ct值越低。Ct值為20可提示高傳染性，Ct值為33～35可提示低傳染性[4]。然而，Ct值易受到樣本采集方法、樣本類型、運輸介質類型、樣本采集到檢測前時間、樣本采集時感染情況、不同檢測方法內和檢測方法間的差異等因素的影響。本研究結果顯示，不同檢測試劑Ct值差異較大，因此對檢測結果陽性且Ct值較高（接近臨界值），或檢測結果陰性但剛超出試劑說明書判讀標準時，實驗室應進行復核，同時使用陰性和弱陽性質控品進行結果監測；有條件的情況下，建議再次采集樣本以核實檢測結果。需要注意的是，此方式僅對避免假陽性結果有幫助，對判斷感染病程幫助不大（如無癥狀感染、癥狀出現前的感染）[12]。

綜上所述，上海地區SARS-CoV-2核酸檢測實驗室檢測能力均能達到要求，但不同品牌檢測試劑Ct值實驗室間差異較大，依據Ct值判讀結果可能會產生假陰性或假陽性結果，應引起實驗室和相關機構重視。