阿膠產品的鑒別方法研究

◎ 張 翠，傅 鵬，林晶潔

（國檢（青島）檢測技術有限公司，山東 青島 266109）

2020 版《中華人民共和國藥典》一部明確了阿膠為馬科動物驢（Equus asinusL.）的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠[1]，具有補血滋陰、潤燥、止血的功效。然而近年來由于供不應求，市場上出現了很多用牛皮或豬皮摻假的阿膠，影響阿膠產品的功效和品質，損害大眾利益。為此，許多研究人員對阿膠的鑒別方法進行了研究，如氨基酸分析法[2]、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法結合主成分分析法[3]、18O 標記聯合高效液相色譜-高分辨率質譜法[4]、超高效液相色譜-三重四極桿質譜法[5-6]等，其中高效液相色譜-質譜聯用法操作簡便、快速，且靈敏度高。因此，參考《中華人民共和國藥典》中的方法對阿膠進行酶解，采用高效液相色譜-質譜聯用法對阿膠、牛皮膠和豬皮膠3 種膠進行鑒別，建立了鑒別阿膠的方法，為阿膠產品品質的監控提供有效依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

阿膠標準品購自中國食品藥品檢定研究院；豬皮膠為自制；牛皮膠、阿膠樣品、阿膠棗樣品和阿膠糕樣品均購自市場；測序級胰蛋白酶購自SIGMA，加50 mmol·L-1乙酸溶液溶解，于-20 ℃冷凍保存，有效期1 年；甲酸、乙酸銨、甲醇均為色譜純；碳酸氫銨為分析純。

LC-MS/MS 1290-6460 高效液相色譜-質譜聯用儀，安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；進樣量：5 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；流動相：A 為0.1%甲酸水+5 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B 為甲醇。流動相梯度洗脫比例見表1。

表1 流動相梯度洗脫比例表

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；電離模式：正離子模式；掃描模式：多反應監測掃描（Multi Reaction Monitoring，MRM）；干燥氣溫度：350 ℃；干燥器流量：10 L·min-1；霧化氣壓力：40 psi；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V。分別將每種動物膠的酶解液注入儀器，在Q1全掃描模式下選出響應較高的母離子；再采用子離子模式，通過改變碰撞能量，掃描子離子。然后將全掃描模式下找到的母離子和子離子模式下找到的響應較高的碎片離子質荷比數據確定為 MRM 掃描模式所需的離子對，詳見表2。

表2 阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對表

1.2.2 前處理過程

取粉碎樣品0.02 g，置于10 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氫銨溶液（pH 值在7～9）8 mL，超聲30 min，加入1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm水相濾膜。取濾液100 μL于進樣瓶內襯管中，加入10 μL胰蛋白酶溶液后搖勻，于37 ℃恒溫酶解12 h 后，注入LC-MS/MS 測定。

2 結果與分析

2.1 阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對

分別取阿膠標準品、牛皮膠和豬皮膠經前處理得到的酶解液進行檢測。由圖1 可知，阿膠標準品酶解液只在阿膠特征離子對（m/z539.8 →612.4）出峰；牛皮膠酶解液只在牛皮膠特征離子對（m/z641.3 →783.3）出峰；豬皮膠酶解液只在豬皮膠特征離子對（m/z505.8 →544.3）出峰。3 種膠的特征離子對出峰時間各不相同，互不干擾。

圖1 3 種膠酶解液的質譜色譜圖

2.2 摻雜模型的建立

為進一步驗證阿膠、牛皮膠和豬皮膠特征肽的專屬性，分別建立了二元和三元摻雜模型。

2.2.1 二元摻雜模型

將阿膠與牛皮膠混合，比例分別為1 ∶1、1 ∶2，分別按1.2.2 前處理步驟酶解后得到二元摻雜模型的酶解液，注入LC-MS/MS 測定。由表3 可看出，驢皮阿膠與牛皮膠的摻雜模型均檢測出牛皮膠和阿膠特征離子對。摻雜模型中阿膠特征離子對和牛皮膠特征離子對的響應與摻雜量呈比例關系。

表3 二元摻雜模型牛皮膠和阿膠特征離子檢測結果表

2.2.2 三元摻雜模型

按阿膠、牛皮膠、豬皮膠摻雜比例為1 ∶1 ∶4，將3 種膠混合后按1.2.2 前處理步驟酶解，得到三元摻雜模型的酶解液注入LC-MS/MS 測定。結果顯示，阿膠、牛皮膠、豬皮膠三元摻雜模型檢測出了阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對，出峰時間分別為1.433 min、1.338 min、1.076 min，互不干擾。

綜上所述，本方法專屬性良好，可用于混合膠的組成分析。

2.3 阿膠產品的檢測

為驗證該鑒別方法對阿膠產品的適用性，將3 種市售阿膠、阿膠棗和阿膠糕按1.2.2 前處理步驟提取、酶解后檢測（阿膠棗和阿膠糕考慮其添加量適當增大稱樣量）。表4 結果顯示，其中兩種阿膠只檢測出牛皮膠特征離子對，在阿膠和豬皮膠特征離子對處未出峰，可能為牛皮膠；有一款阿膠、阿膠棗和阿膠糕均只檢測出阿膠特征離子對，在牛皮膠和豬皮膠特征離子對處未出峰，因此推斷為真正的阿膠產品。

表4 各阿膠產品檢測結果表

3 結論

本研究采用胰蛋白酶酶解阿膠、牛皮膠和豬皮膠，通過比較這3 種酶解產物特征多肽的差異識別出不同動物來源（阿膠、牛皮膠和豬皮膠）的酶解產物的特征離子對，該方法具有專屬性強、靈敏度高的特點。通過建立阿膠、牛皮膠和豬皮膠摻雜模型，證明該方法可以用于混合膠的組成和鑒別分析。本研究建立的通過分析特征離子對追溯阿膠產品動物來源的方法，為阿膠產品的品質監控和鑒別提供了技術性支持。