淡水產品及其暫養水中丁香酚類化合物風險研究

◎ 萬素琴，王多嬌，顏春榮，徐春祥，周 雪，張金秋

（江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210000）

丁香酚是一種常見的有機化合物，由于其自身具有一種濃郁的香味，常常被用作香料應用于各種精油中，還可作為一種食用香料使用。丁香酚學名4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子式為C10H12O2，在常溫下主要呈現油狀液態，顏色為淡黃色和透明色，密度為1.06 g·cm-3，熔點為-10 ℃，沸點高達254 ℃，微溶于水且完全溶于部分有機溶劑。丁香酚化學結構如圖1所示。

圖1 丁香酚化學結構圖

丁香酚價格低廉且具有良好的麻醉效果，常作為水產品的麻醉劑，并廣泛應用于鮮活水產品的養殖、運輸等領域，其安全性及殘留控制等問題引發了諸多關注。當前國際相關領域認為將丁香酚用于水產品的麻醉具有一定的風險，歐洲食品安全局認為丁香酚達到一定含量會對生物的皮膚和視力產生影響；美國食品藥品管理局對于丁香酚的使用有非常嚴格的規定，明令禁止在水產品中出現丁香酚，被劃分為第3 類致癌物；部分東亞和大洋洲國家對于丁香酚的應用很開放，日本規定丁香酚的最高殘留量（Maximum Residue Limit，MRL）設定為0.05 mg·kg-1，但規定了丁香酚的休藥期，甲殼類休藥期為10 d；新西蘭規定了丁香酚的最大殘留限量為0.1 mg·kg-1[1-3]。我國尚無明確的法規規定丁香酚類化合物可以作為水產麻醉劑使用，僅在GB 2760ü 2014 中規定丁香酚可作為食品級香料，但在水產品的使用卻沒有明確的規定。本實驗對市售淡水產品進行檢測，通過科學、有效的監測方式對淡水產品及暫養水中存在的丁香酚類化合物的種類、含量進行分析。同時對丁香酚類化合物在水產品中的殘留量進行了動態監測，使用魚用麻醉劑對鮮活鯽魚進行麻醉給藥實驗，觀察麻醉效果以及殘留量消除情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙酰基異丁香酚（DR.E）；淡水魚（農貿市場）；乙腈、正己烷、二甲亞砜（色譜純，MERCK）。魚用麻醉劑（農貿市場和網絡采樣）。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2020 島津氣相色譜-質譜聯用儀（配有電子轟擊電離源）；7890B-7000D 安捷倫氣相色譜-質譜聯用儀（配有電子轟擊電離源）；XW-80A 旋渦混合器（上海醫大儀器有限公司）；SL16R 高速離心機（美國賽默飛公司）；氮吹儀（tegent）；電子天平（METTLER）；增氧泵。

1.3 實驗方法

1.3.1 動態監測麻醉給藥實驗

市場自購鯽魚40 條，分成3 組，分別為空白對照組和2 個不同濃度丁香酚給藥組。低濃度長時間：丁香酚給藥濃度20 mg·L-1時，麻醉時長10 h；高濃度短時間：丁香酚給藥濃度100 mg·L-1，麻醉時長為5 min。用水沖洗后在放入復蘇空白池開始計時，在0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、12.0 h、24.0 h和48.0 h進行取樣，觀察記錄鯽魚復蘇存活情況。觀察記錄魚體的外觀和臟器變化，同時按照實驗樣品處理步驟對其體中丁香酚類的含量進行測定，具體實驗流程見圖2。

圖2 丁香酚麻醉實驗流程圖

1.3.2 樣品前處理

稱取2.0 g 磨碎的魚腹部位魚肉樣品（去鱗、去頭、去內臟）于50 mL 離心管中，加入一個陶瓷均質子、5 g無水Na2SO4和10 mL 乙腈，超聲20 min，8 000 r·min-1離心3 min，收集上清液，以同樣的方法重復提取一次，合并上清液，加入5 mL 乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min，8 000 r·min-1離心8 min，棄去上清液，然后加入50 μL 二甲基亞砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，渦旋0.5 min，有機相濾膜過濾，采用氣相色譜-質譜聯用儀測定6 種丁香酚類化合物的含量。

稱取5 g淡水產品的暫養水樣于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋5 min，加入5 g 無水MgSO4和一個陶瓷均質子，繼續渦旋5 min，然后5 000 r·min-1離心5 min，準確移取4 mL 上清液于50 mL 離心管中，加入50 μL 二甲基亞砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈，渦旋30 s，有機相濾膜過濾，采用氣相色譜-質譜聯用儀測定6 種丁香酚類化合物的含量。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相色譜參數。色譜柱：VF-1701（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：柱溫初始為90 ℃，保持2 min，然后以5 ℃·min-1升至210 ℃，再以20 ℃·min-1升至250 ℃，保持1 min；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL·min-1；進樣口溫度：230 ℃；進樣模式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

（2）質譜參數。電離方式：電子轟擊電離源（EI）；EI 能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：6.00 min；采集方式：離子監測。

2 結果與分析

2.1 市售淡水魚及暫養水結果分析

通過對市售淡水魚進行暫養并測定，檢出丁香酚，色譜圖見圖3。同時選取空白基質樣品，在不同濃度的水中暫養并進行測定，實驗室暫養水檢出濃度最高為24 mg·kg-1。檢出樣品中，草魚重量為1.98 kg，檢出丁香酚為8.3 mg·kg-1；鯽魚重量為0.65 kg，檢出丁香酚為0.043 mg·kg-1，說明丁香酚殘留量與魚體本身品種和個體大小有關，隨著魚體增大，其耗氧量也隨之增加，魚用麻醉劑檢出量也隨之增加。

圖3 陽性鯽魚樣品SIM 模式下質譜圖

影響丁香酚代謝殘留的因素主要是魚的品種、個體大小以及不同的給藥方式，其他影響因素有溫度、濕度、鹽度、pH 值等。有研究表明，提升水溫能夠很好地控制麻醉和復蘇時間，使水產品的代謝率得到顯著提升[4-6]。

2.2 市售麻醉劑結果分析

對6 種采購的魚用麻醉劑進行質譜掃描并和NIST庫比對，其匹配度最高的化合物都為丁香酚（圖4）。

圖4 1 μg·mL-1“漁夫寶”麻醉劑質譜圖

2.3 丁香酚對鯽魚的麻醉效果觀察及殘留消除研究

丁香酚對魚的麻醉給藥實驗表明，低濃度的麻醉和蘇醒耗時長，高濃度麻醉和蘇醒耗時短，復蘇率均為100%，且48 h 存活率依舊不變。給藥復蘇后的鯽魚與空白對照組比較而言，魚體本身無肉眼可見變化，但活力相較于空白對照魚明顯變弱，魚體黏液減少；魚鱗明顯變松，內臟顏色變深。高劑量組可能因麻醉效果快、在藥水中浸泡時間短，內臟顏色相較于低劑量組略淺，但給藥組總體比空白組內臟顏色加深，結構上也呈松散狀態。

不同麻醉方式下丁香酚在鯽魚肉中的殘留情況如圖5 所示。結果顯示，鯽魚低濃度長時間麻醉后魚肉中富集丁香酚的最高濃度為31.9 mg·kg-1，高濃度短時麻醉后魚肉中富集的最高濃度為11.4 mg·kg-1；表明高濃度快速麻醉實驗下鯽魚體內丁香酚殘留量低于低濃度長時間麻醉下的鯽魚。不同濃度的給藥實驗后復蘇的鯽魚體內丁香酚殘留量持續減少，2～4 h 消除最快。4 h 后殘留消除率明顯降低。低濃度長時間麻醉實驗組和高濃度短時麻醉實驗組在清水中復蘇24 h 后殘留量分別為1.8 mg·kg-1和2.4 mg·kg-1，48 h 后鯽魚體內丁香酚殘留量明顯降低且趨于平衡，但最低含量仍有0.078 mg·kg-1。因此，需要全面考量不同的影響因素，為休藥期的設定提供可靠依據，持續動態監測市場上水產品麻醉劑的使用。

圖5 不同給藥濃度下丁香酚在鯽魚體內殘留情況圖

3 結論與討論

丁香酚類化合物是市場上常見的魚用麻醉劑的主要成分，由于水產品在運輸的過程中極易受到水溫、水密度、顛簸或者擁擠等因素的影響，導致耗氧量提升、呼吸代謝加快、二氧化碳排放量升高，使得水產品應激、感染、死亡[7-9]。因此，水產市場上常用麻醉保活的方式提高水產品的存活率。

丁香酚類化合物在魚中的殘留自消除規律的研究結果表明，高濃度短時麻醉殘留量低且不影響鯽魚的復蘇率和存活率，建議在實際運輸中選擇高濃度短時麻醉的方式。高濃度短時麻醉下，48 h 后丁香酚的殘留含量仍有0.078 mg·kg-1，需要進一步研究丁香酚類化合物在鯽魚中的代謝規律，確定更合理的用藥量、用藥時間和休藥期。殘留在魚肉中的丁香酚類化合物可能會危害人體健康，應盡快制定相關的風險評估、制定相關法律法規和標準，以及相應的快檢方法，保障消費者的健康。