分子蒸餾技術分步法制備酶促酯交換反應的高含量ω-3 PUFA魚油甘油酯

沈琳潔，林榮發，張連岳，馮傳志，傅 紅

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

海洋浮游植物和藻類含有的ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）經食物鏈參與海洋魚類脂質代謝[1]，其中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在預防和治療心血管疾病、癌癥、糖尿病、炎癥等方面發揮重要作用[2-6]。天然深海魚油中EPA和DHA以構成甘油三酯（triacylglycerol，TG）的脂肪酸形式存在，其總含量一般不超過30%；利用化學醇解及濃縮技術制備的乙酯型魚油可以將ω-3 PUFA含量提高到50%以上[7]。但是近年研究發現，乙酯中的ω-3 PUFA不僅比TG需要額外的羧基脂肪酶水解，而且對胰脂肪酶水解抵抗能力比TG高50 倍，這顯著降低了乙酯中ω-3 PUFA的消化吸收效率[8-10]；另外乙酯在體內分解產生的乙醇容易引發乙醇不耐癥人群和嬰幼兒的不良反應[11]。因此，制備食用安全性好和生物利用率高的高ω-3 PUFA含量甘油酯型魚油產品，成為特醫食品等領域的新經濟增長點，目前挪威、丹麥、韓國等在此領域已具備較成熟的商業化技術，我國正處于研發和試生產階段[12]。

利用脂肪酶油脂改性技術，以天然魚油和乙酯型魚油為底物制備高ω-3 PUFA含量的魚油甘油酯產品是目前魚油高附加值產業發展方向[13-14]?，F有文獻主要集中于脂肪酶類型選擇和反應條件參數優化，對酯交換產物的分離及其副產物再利用的研究較少。乙酯型魚油原料價格貴，利用傳統的減壓分離技術難以完全分離成分復雜的酯交換產物魚油甘油酯，成為限制工業化生產的重要因素。分子蒸餾技術加熱溫度低、受熱時間短，可以根據脂肪酸碳鏈長度和飽和程度對油脂熱敏性成分進行高效的多組分分離。在酯交換混合產物分離方面，He Jianlin等[15]報道了酶促乙醇反應結合分子蒸餾技術提高藻油DHA含量的方法，蒸餾溫度150 ℃和真空度≤1×10-3MPa分離得到富含DHA甘油酯的重組分和含有棕櫚酸、DHA乙酯的輕組分；Wang Xiumei等[16]用酶催化乙酯與甘油反應生成含有76.46% TG的產物，分子蒸餾溫度175 ℃、真空度3 Pa時分離產物中的甘油二酯和乙酯，最終將TG含量提高至96.2%；?tefan等[17]分離山茶油中的游離脂肪酸時，分子蒸餾的脫酸效率可達92%。另外，在PUFA富集方面，傅紅等[18]通過二級分子蒸餾，獲得了63%ω-3 PUFA含量的乙酯型魚油；余瑤盼等[19]在真空壓力1 Pa、一級蒸餾溫度120 ℃和二級蒸餾溫度160 ℃時，將石榴籽油共軛亞麻酸乙酯含量從80.68%提升至95.23%。

本研究在脂肪酶促酯交換技術制備高ω-3 PUFA含量的魚油甘油酯產品研究基礎上[13,20-23]，采用分子蒸餾法分步應用于魚油酯交換反應產物的分離。通過一級分子蒸餾技術分離魚油酯交換產物中的一級重相產物甘油酯（包括TG、甘油二酯和甘油單酯）和一級輕相副產物，并采用高溫氣相色譜及核磁共振氫譜等技術驗證產物的分離效果；將一級輕相副產物直接參與下一級的酶促酯交換反應中，或再通過分子蒸餾技術富集輕相乙酯副產物中的ω-3 PUFA，參與下一級的酶促酯交換反應，以此制備不同ω-3 PUFA含量等級的甘油酯型魚油產品，實現原料和副產物的最大化利用，降低原料成本。分子蒸餾技術在酶促酯交換產物分離工藝中的高效使用，可以為實現綠色、能源節約型高含量ω-3 PUFA的魚油甘油酯產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料TG型魚油（ω-3 PUFA含量≤30%）、原料乙酯型魚油（ω-3 PUFA含量≥75%）福建天馬科技集團有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 丹麥諾維信公司；正己烷等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FMD-150分子蒸餾儀 杜馬司科學儀器（江蘇）有限公司；AVANCE NEO 600核磁共振波譜儀 德國Bruker公司；GC7890A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；CH1020B超級恒溫水浴槽 沙鷹科學儀器（上海）有限公司；HJ-4A磁力攪拌器 北京浩開科技有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯交換產物制備

以質量比1∶1將TG型魚油和乙酯型魚油作為反應底物置于夾套燒杯中，加入3%（以原料總質量計）的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，密封燒杯口后于52 ℃恒溫磁力攪拌器避光反應24 h[20]。酯交換反應結束后，80 ℃保持20 min使酶滅活，8000 r/min離心10 min去除脂肪酶固體，得到一級酯交換反應產物魚油混合酯。

1.3.2 分子蒸餾分步制備工藝

在體系壓強5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉速240 r/min和進料速率0.2 mL/min的一級分子蒸餾優化條件下，分離一級酯交換產物獲得分離產物一級重相和一級輕相。其中一級輕相既可直接參與二級酯交換反應和分子蒸餾分離（反應條件和一級相同），也可將一級輕相再經分子蒸餾富集其中的ω-3 PUFA后，再參與二級酯交換反應和分子蒸餾分離。上述工藝得到不同等級的魚油甘油酯產品，工藝流程圖如圖1所示。

圖1 不同ω-3脂肪酸含量等級的甘油酯型魚油產品的分步制備Fig.1 Flow chart for the preparation of triglyceride-type fish oil products with different ω-3 fatty acid contents

1.3.21 酯交換混合產物中甘油酯的分離

稱取一定量酯交換產物魚油加入分子蒸餾加料罐，探究分子蒸餾體系壓強、蒸餾溫度、刮板轉速和進料速率對重相中的甘油酯型魚油ω-3 PUFA（EPA＋DHA）含量的影響。將薄層制備色譜法得到的酯交換反應產物中甘油酯混合譜帶（包括TG、甘油二酯和甘油單酯三條譜帶）ω-3 PUFA含量作為標準值，按下式計算分子蒸餾重相中的ω-3 PUFA含量和前者的相對偏差，相對偏差越小，說明分離效果越好，其中ω-3 PUFA含量由氣相色譜法測定。

式中：X1為分子蒸餾重組分中ω-3 PUFA含量；X2為薄層制備色譜甘油酯中ω-3 PUFA含量。

1.3.22 分子蒸餾富集一級輕相的ω-3 PUFA

稱取一定量一級輕相加入分子蒸餾加料罐，在體系壓強5 Pa時探究刮板轉速、冷凝溫度和蒸餾溫度對一級輕相中的ω-3 PUFA富集效果的影響。收集ω-3 PUFA富集相，經氣相色譜檢測其EPA＋DHA含量，并按下式計算乙酯型魚油富集相得率。

式中：m富為富集相乙酯型魚油的質量/g；m進為進料乙酯型魚油的質量/g。

1.3.3 薄層色譜法分析產物及制備甘油酯

稱取一定量樣品溶解于50 μL正己烷，用定量點樣毛細管吸取1 μL在距薄層板底邊2 cm處點上直徑＜4 mm的圓點，放入展開缸中（展開劑為正己烷∶乙醚∶甲酸=80∶20∶2，V/V）。利用上行法展開，待展開劑上升至距薄層板頂端2 cm處時取出晾干，噴灑茴香醛顯色劑，在110 ℃加熱條件下根據Rf值判斷各脂質組分[24]。

將30 mg未經分子蒸餾分離的酶促酯交換反應混合產物溶解于50 μL正己烷，均勻點樣于20 cm×20 cm薄層板上并連成1 條直線，用展開劑（正己烷∶乙醚∶乙酸=80∶20∶1，V/V）進行層析，展開結束晾干后噴灑2’,7’-二氯熒光素顯色劑，在紫外燈下觀察并刮下甘油酯混合譜帶（包括TG、甘油二酯和甘油單酯3 條譜帶）對應區域[25-26]。按上述方法收集制備的3～5 份混合譜帶樣品，氣相色譜分析脂肪酸含量。

1.3.4 分離產物的甘油酯成分和脂肪酸組成分析

1.3.41 高溫氣相色譜法測定分子蒸餾分離產物組成

取樣品溶解于正己烷溶劑中，通過高溫氣相色譜法分析重組分組成。色譜條件：Agilent 7890A氣相色譜儀；Agilent VF-5ht高溫柱子；檢測器為氫火焰離子化檢測器；進樣口溫度325 ℃，檢測器溫度340 ℃，色譜柱升溫程序：以5 ℃/min從50 ℃升到400 ℃。進樣量2 μL，分流比為100∶1[27]。

1.3.42 氣相色譜法測定脂肪酸組成

樣品采用甲酯化處理，經氣相色譜法測定脂肪酸組成。色譜條件：Agilent 7890A氣相色譜儀；Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性柱；氫火焰離子化檢測器；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃；色譜柱升溫程序：40 ℃保持2 min，以55 ℃/min升至171 ℃，保持25 min，再以10 ℃/min升至215 ℃，保持25 min，直至分析完成；載氣為純氮氣，流速30 cm/s，橫流模式，氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min，尾吹氣為氮氣，流速為25 mL/min，進樣量1 μL，分流比為20∶1[28]。

1.3.5 核磁共振氫譜法分析甘油酯分離效果

分別稱取50 mg樣品溶于500 μL氘代氯仿后裝入5 mm核磁管，置于600 MHz運行的核磁共振波譜儀測試，獲得核磁共振氫譜。參數條件：以四甲基硅烷為內標物，掃描次數32 次，脈沖寬度90°，采集時間2.7525 s，譜寬12×10-6，脈沖間隔1 s，脈沖序列zg30[29]。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 2021軟件繪圖，并使用MestReNova軟件分析核磁共振氫譜圖。數據為3 次實驗測定的平均值，以±s表示。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜法分析產物成分

在前期工藝參數優化酶促原料TG型魚油和原料乙酯型魚油的酯交換反應基礎上[13,20-21]，采用分子蒸餾技術分離酯交換產物的甘油酯，分離產物為分子蒸餾重相和分子蒸餾輕相兩部分。圖2是反應底物、酯交換反應后的混合產物及其一級分子蒸餾效果較完全的分離產物（一級重相、一級輕相）薄層色譜圖，其中重相在膽固醇酯、TG、甘油二酯和甘油單酯所對應的譜帶上有清晰的斑點，輕相則含有乙酯型魚油和游離脂肪酸的斑點。因此由薄層色譜圖初步判斷，分子蒸餾法可以將乙酯型魚油等副產物從甘油酯中分離。

圖2 酯交換底物及一級分子蒸餾分離產物的薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatograms of transesterification substrates and primary molecular distillation products

2.2 分子蒸餾分離酯交換產物的工藝條件

一級分子蒸餾的各工藝因素優化效果見圖3。由圖3a可知，在本分子蒸餾設備能夠達到的最小體系壓強5 Pa時，重相ω-3 PUFA含量相對偏差最小達到6.02%。圖3b顯示，在110～150 ℃時，隨著分子蒸餾溫度的升高，重相ω-3 PUFA分離的相對偏差降低，當蒸餾溫度為140 ℃時達到1.19%，繼續提高蒸餾溫度相對偏差無明顯降低；這是因為蒸餾溫度的升高有助于高真空條件下各組分根據平均自由程的差別而實現完全分離，游離脂肪酸和乙酯型魚油充分逸出到輕組分，甘油酯型魚油則被留在重相。圖3c表明，刮板轉速為180～260 r/min時相對偏差先下降后升高，當刮板轉速達到240 r/min時相對偏差達到最小；提高刮板轉速使物料在蒸發面上形成的液膜厚度降低，導致傳熱和傳質過程更加完全；但繼續增加轉速使蒸發面上的料液流速加快，輕相不能完全逸出。圖3d顯示，進料速率越慢相對偏差越小，因為料液在蒸發面上滯留時間延長有助于達到充分的傳熱傳質，使分子平均自由程小的游離脂肪酸和乙酯型魚油有足夠的時間逸出，和重相分離。在分子蒸餾分離酯交換產物的體系壓強5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉速240 r/min和進料速率0.2 mL/min優化條件下，重相甘油酯和輕相乙酯型魚油的分離效果分別對應于圖2第4、5條薄層色譜譜帶。

圖3 分子蒸餾壓強（a）、蒸餾溫度（b）、刮板轉速（c）、進料速率（d）對重相ω-3 PUFA分離相對標準偏差的影響Fig.3 Effects of molecular distillation pressure (a),distillation temperature (b),scraper speed (c),and feeding rate (d) on the relative standard deviation of ω-3 PUFA separation from heavy phase

2.3 分子蒸餾技術富集一級輕相乙酯型魚油的ω-3 PUFA含量

一級分子蒸餾得到的輕相乙酯型魚油副產物，可以進一步通過分子蒸餾富集其ω-3 PUFA含量再進行二級酶促酯交換反應。由圖4a可知，提高刮板轉速乙酯型魚油富集相ω-3 PUFA含量先升高后下降，得率呈緩慢上升趨勢。這是因為刮板轉速太慢導致蒸發壁面形成液膜厚度大，不利于傳質傳熱；刮板轉速過快液膜內流體的徑向速度顯著增大，導致飛濺現象[30-31]；當刮板轉速至240 r/min時有利于形成均勻的液膜狀態，達到理想的分離效果。由圖4b可知，隨著冷凝溫度升高，分離產物富集相的ω-3 PUFA含量略呈下降趨勢，得率略呈上升趨勢，冷凝溫度為20 ℃能夠達到較好的分離效果。圖4c顯示，分子蒸餾壓力為5 Pa時，蒸餾溫度的升高使產物富集相ω-3 PUFA含量上升、得率下降；當蒸餾溫度為110 ℃時，ω-3 PUFA含量由蒸餾前的60.73%提高到78.01%，富集相得率為32.97%。

圖4 刮板轉速（a）、冷凝溫度（b）、蒸餾溫度（c）對一級輕相中ω-3 PUFA含量富集效果的影響Fig.4 Effects of scraper speed (a),condensation temperature (b) and distillation temperature (c) on the enrichment of ω-3 PUFA in the first-stage light phase

2.4 分子蒸餾分離產物的組成和脂肪酸含量

2.4.1 分子蒸餾產物組成分析

一級分子蒸餾的輕相副產物通過分子蒸餾富集其ω-3 PUFA，進行二級酶促酯交換反應和二級分子蒸餾產物分離，根據游離脂肪酸、乙酯型魚油和不同酰基甘油酯的等價碳數不同，利用高溫氣相色譜分析各組分[32]。乙酯型魚油富集相參與的兩級分子蒸餾產物組成及含量見表1，其中酯交換反應混合產物、油酸乙酯標準樣品、一級分子蒸餾產物重相的高溫氣相色譜圖見圖5。表1結果表明，經一級分子蒸餾后，酯交換魚油產物中的游離脂肪酸、乙酯和微量甘油單酯進入輕相，而甘油二酯、TG和大多數甘油單酯則進入重相；一級重相中的游離脂肪酸含量為0.54%，甘油單酯、甘油二酯和TG的含量分別達到14.23%、24.01%和61.22%；一級重相得率為47.13%，一級輕相得率48.36%，總損耗率4.51%。一級輕相經分子蒸餾富集ω-3 PUFA后的富集產物中含有98.86%乙酯，若乙酯型魚油富集相繼續參與二級酶促酯交換反應和二級分子蒸餾，獲得的二級產物重相中的甘油單酯、甘油二酯和TG的含量分別達到16.28%、19.31%、63.95%，二級重相和輕相得率分別為46.23%和47.81%，總損耗率5.96%。

表1 一級輕相富集ω-3 PUFA后的兩級分子蒸餾產物組成及含量Table 1 Changes in composition of the first-stage heavy and light phase after sequential ω-3 PUFA enrichment and secondary molecular distillation %

圖5 高溫氣相色譜法分析酯交換反應混合產物（a）、油酸乙酯標樣（b）和一級分子蒸餾產物重相（c）Fig.5 HTGC chromatograms of transesterification products (a),ethyl oleate standard (b),and heavy phase of primary molecular distillation products (c)

2.4.2 脂肪酸組成分析

氣相色譜法分析酯交換原料和分子蒸餾分步制備產物的各脂肪酸組成和含量，結果見表2。原料TG型魚油和原料乙酯型魚油的ω-3 PUFA含量分別為29.65%和83.75%，經酶促酯交換反應和一級分子蒸餾后，一級重相的ω-3PUFA含量達到53.76%，一級輕相的ω-3 PUFA含量達到60.73%。當進一步采用分子蒸餾富集一級輕相的ω-3 PUFA含量后，富集相的ω-3 PUFA含量提高到78.01%；將其與原料TG型魚油進行二級酶促酯交換反應及二級分子蒸餾分離后，得到的二級重相1的ω-3 PUFA含量達到51.38%。若一級輕相不經分子蒸餾富集，直接作為二級酯交換底物與原料TG型魚油進行酯交換反應，則二級重相2的ω-3 PUFA含量僅達到42.37%。上述兩級酯交換魚油甘油酯產品的脂肪酸含量均符合CXS 329-2017《國際食品法典標準 魚油》對濃縮甘油酯型魚油（EPA＋DHA=35%～50%）的定義[33]，因此采用分子蒸餾分步制備酯交換產物技術，可以實現魚油甘油酯ω-3 PUFA含量的分級，增加產品的多元化。

表2 兩級酶促酯交換反應及分離產物的脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid composition and content of two-stage enzymatic transesterification products and molecular distillation products %

2.5 分子蒸餾產物中重組分魚油甘油酯結構分析

利用核磁共振氫譜法分析分子蒸餾分離酯交換產物一級重相的脂質組分。氫原子受不同脂肪酸組成和脂質類型中化學環境的影響，表現為核磁共振氫譜中化學位移的信息不同[34]。原料TG型魚油、原料乙酯型魚油、未分離的酯交換反應混合產物和一級分子蒸餾重相4 種樣品核磁共振氫譜依次如圖6所示。

圖6 酯交換反應及分子蒸餾分離產物的核磁共振氫譜全譜圖及δ 1.2～1.3局部放大譜圖Fig.6 1H-NMR spectra with zoom-in at δ 1.2-1.3 of different fish oil samples

對比圖6a、b，酯交換原料TG型魚油和乙酯型魚油的核磁共振氫譜存在δ1.2～1.3和δ4.15～4.35的兩處差異，其中原料TG型魚油和分子蒸餾分離的一級重相魚油只有δ1.267處明顯的單峰，原料乙酯型魚油有δ1.248和δ1.251兩個化學位移信號峰；從信號峰強度看出，原料乙酯型魚油的DHA含量為72.97%，明顯高于EPA含量8.84%，圖中δ1.251對應的DHA乙酯的—CH3基團振動的信號峰強度更高，這和理論上推測出DHA中最近的C＝C（C4位置）更接近其乙基的—CH3部分，所以與δ1.248 和δ1.251的—CH3基團共振分別歸屬于EPA和DHA乙酯的結論一致[35]；相比之下，原料TG型魚油和一級分子蒸餾分離的重相魚油并未顯示出上述基團振動峰。另外，根據魚油產品核磁共振氫譜各信號峰的歸屬可知[36]，甘油酯型魚油在δ4.15～4.35的雙二重峰（峰L）來源于TG主鏈上sn-1,3位的—CH2OCOR基團共振，乙酯型魚油在δ4.12處顯示明顯的多重峰（峰K）來源于乙酯末端—CH2OCR。酯交換混合產物核磁共振氫譜呈現出兼具甘油酯型魚油和乙酯型魚油的譜圖特征，但經分子蒸餾分離的重相魚油核磁指紋圖譜與原料TG型魚油的特征基本一致，兩者在δ4.15～4.35處峰高的差異可歸因為酯交換后TG骨架sn-1,3位置氫原子分布的復雜化。因此，核磁共振氫譜分析結果進一步說明了分子蒸餾分離的重相魚油屬于甘油酯型產品，不含乙酯型魚油。

3 結論

采用分子蒸餾方法，對脂肪酶促油脂改性技術制備食用安全性好和生物利用率高的高含量ω-3 PUFA魚油甘油酯產物進行有效分離和乙酯型魚油再利用。酶促酯交換產物在分子蒸餾壓強5 Pa、蒸餾溫度140 ℃、刮板轉速240 r/min和進料速率0.2 mL/min時，重相ω-3PUFA含量和薄層層析分離制備ω-3 PUFA含量的相對偏差最小，不含乙酯型魚油副產物，一級重相ω-3 PUFA含量由原料TG型魚油的29.65%提高到53.76%；再通過分子蒸餾進一步富集乙酯型魚油副產物中的ω-3 PUFA，蒸餾壓強5 Pa、蒸餾溫度110 ℃、刮板轉速240 r/min和冷凝溫度20 ℃時，一級輕相中ω-3 PUFA含量由60.73%提高到78.01%，富集相得率為32.97%，其參與二級酶促酯交換反應和分離獲得二級重相1ω-3 PUFA含量達到51.38%。若一級輕相直接參與二級酯交換反應和分離，其二級重相2ω-3 PUFA含量僅為42.37%。采用分子蒸餾分步制備技術可以獲得不同ω-3 PUFA含量等級的甘油酯型魚油產品，同時實現原料和副產物的最大化利用。