4 種真菌發酵對三七葉化學成分及藥理活性的影響

楊金梅，李云嵌，何霞紅，王振興,*

（1.西南林業大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業大學林學院，云南 昆明 650224；3.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

三七（Panax notoginseng）為我國傳統名貴植物，為五加科（Araliaceae）人參屬，主要分布于我國云南文山、廣西、廣東、福建等地[1]。三七的葉、果以及根莖均可藥用，其味甘、微苦，性溫，現代藥理研究表明，三七具有鎮痛、抗炎、保肝利膽、抗心律失常、抗血栓等作用[2]。三七葉是云南當地特色食品，具有與根部相似的藥用價值。研究表明三七葉富含皂苷、總黃酮、多酚、多糖等活性成分[3]，具有活血化瘀、止痛消炎、促進消化等多種功能活性[4-6]。但是目前對于三七葉的開發利用較少，只有三七葉茶、粉等產品，造成嚴重的資源浪費，因此迫切需要加大對三七葉的開發利用。

利用食用真菌或細菌發酵是對植物基食品進行增效加工的有效手段之一，在發酵過程中，微生物發酵可作用于植物中多糖、蛋白質等成分[7]，促進有效成分的釋放，同時將難于吸收的大分子代謝成小分子[8]，增加植物有效成分的含量[9]，或者可將低活性有效成分轉化為高活性有效成分，具有無污染、酶活性高、轉化率高、成本低、周期短、可以實現工業化等優點[10]。目前已有利用食用微生物進行發酵三七葉的相關研究，如張媛媛等[11]通過凝結芽孢桿菌發酵三七葉茶，發現發酵可以提高三七葉的總皂苷含量，提高其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力。陳紅惠等[12]發現經黑曲霉發酵后的三七葉茶具有較好的抗氧化能力。Yang Min等[13]發現釀酒酵母和枯草芽孢桿菌共發酵三七葉后，其皂苷、酚酸、黃酮類化合物等活性物質含量顯著增加，并表現出良好的抗氧化活性。此外，益生菌發酵對三七葉中主要活性成分皂苷具有一定的轉化作用，如Li Fei等[14]利用真菌Cordyceps sinensis和Ascomycotasp.將常見人參皂苷Rb1轉化為稀有人參皂苷Rg3和CK。Liu Chunying等[15]發現黑曲霉能將原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd轉化為稀有人參皂苷CK。相對細菌而言，真菌對皂苷的轉化時間更短，轉化率更高，其產物中功能性較強的人參皂苷Rg3、Rg2和CK含量更高[16]。但這些研究主要是利用單一菌株或者復合菌株對三七葉進行發酵，有必要針對不同菌株對三七葉的發酵性能進行比較，從而篩選出適合三七葉發酵的優質菌株。

米根霉（Rhizopusoryzae）、粗糙脈孢菌（Neurosporo crassa）、紅曲霉（Monascus）和魯氏毛霉（Mucor rouxianus）是食品領域常用的4 種真菌，其中米根霉具有發達的淀粉和蛋白酶系，是藥和酒曲中的優勢菌種，在我國傳統發酵中十分重要[17]；粗糙脈孢菌高產纖維素酶、漆酶和多種消化酶，適合于發酵含纖維素較高的木本植物[18]；紅曲霉在我國已有1000多年的食品發酵歷史，其能利用多種糖類和酸類、有機氮等，生成多種蛋白酶、淀粉酶等初級代謝產物和紅曲色素、抗菌素等次生代謝產物[19]；魯氏毛霉是一種接合菌綱真菌，主要用于食品發酵，其分解纖維素的能力較強[20]。考慮到三七葉含有豐富的多糖、蛋白、纖維等成分[21]，本研究選用上述4 種真菌對三七葉進行發酵，研究其化學成分和功能活性的變化，篩選出對三七葉功能活性增效最明顯的菌株，并分析其發酵過程中的代謝物變化，以探討其發酵機制。旨在為三七葉發酵食品的菌株選擇提供參考，并為三七葉的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七葉，2021年11月采收于云南省昆明市尋甸縣羊街鎮豐樂林下三七種植基地，經西南林業大學植物學教研室戚建華副教授鑒定為三七的葉子，真空冷凍干燥，粉碎并過40目篩，-20 ℃保存。葉片橢圓形或倒卵形，長約5～9 cm，寬約2～5 cm。粗糙脈孢菌經本實驗室從發酵豆腐渣中分離純化所得；米根霉（CICC 3037）、紅曲霉（CDMCC 3.438）、魯氏毛霉（CICC 40933）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

沒食子酸、D(＋)-無水葡萄糖、阿卡波糖、ABTS、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside，PNPG）、水溶性VE（Trolox）、三七總皂苷 上海源葉生物科技有限公司；蘆丁、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；α-葡萄糖苷酶（700000 U/mL）北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜級）美國Millipore公司；氨水（色譜級）德國Merck公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FD-304箱式真空冷凍干燥機 濟南駿德儀器有限公司；XINYI-IID超聲波粉碎機、SB-400DTY超聲波清洗機 寧波新藝超聲設備有限公司；BSA224S電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Infinite F50酶標儀帝肯貿易有限公司（上海）；Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜系統 日本島津公司；Q Exactive plus質譜儀美國賽默飛世爾科技公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與培養

將米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉和魯氏毛霉分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基上，25 ℃恒溫培養[22]。待菌種長滿平板后，用打孔器打取已活化好的菌種并接種到PDA液體培養基中，得到濃度為1×105個/mL的菌懸液[23]。

1.3.2 樣品及發酵液制備

取4 g三七葉粉末，加100 mL蒸餾水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫后，接種4 mL濃度為1×105個/mL的菌懸液，于28 ℃、150 r/min搖床中培養10 d，每隔24 h等體積取樣一次，取樣后置于4 ℃冰箱中停止發酵，并將所有樣品保存在-20 ℃冰箱備用[13]。在不含菌種的三七葉溶液中取樣，作為空白對照，即為第0天發酵液。隨后，加入無水乙醇使發酵液中乙醇的體積分數為80%，然后置于50 ℃水浴超聲（160 W，40 kHz）提取2 h，離心后取上清液置于-20 ℃冰箱[24]。

1.3.3 總皂苷含量測定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法[25]測定。40 μL樣品溶液，于80 ℃恒溫水浴鍋中蒸干溶劑后加入20 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應，在540 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/mL三七總皂苷溶液的吸光度，繪制標準曲線，得到公式Y=1.7768X＋0.0586（R2=0.995），根據公式計算總皂苷含量。

1.3.4 總多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[26]測定總多糖含量。50 μL樣品溶液，加入50 μL 5%苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，40 ℃水浴恒溫10 min，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為20、40、60、80、100、150、200 μg/mL的D(＋)-無水葡萄糖溶液的吸光度，繪制標準曲線，得到公式Y=4.818X＋0.2156（R2=0.9915），根據公式計算總多糖含量。

1.3.5 總酚和總黃酮含量測定

采用福林-酚法[27]測定總酚含量。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L碳酸鈉溶液，避光反應30 min后，于765 nm波長處測定吸光度，以100 μL蒸餾水代替碳酸鈉溶液作對照組。同等條件下測定沒食子酸質量濃度為10、20、40、60、80、100 μg/mL時的吸光度，并繪制沒食子酸標準曲線，得到公式Y=0.009X＋0.0365（R2=0.9978），根據公式計算總酚含量。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[28]測定總黃酮含量。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L亞硝酸鈉溶液，室溫反應6 min，加入20 μL 100 g/L硝酸鋁溶液，室溫反應6 min，加入140 μL 40 g/L氫氧化鈉溶液，室溫反應15 min后，于510 nm波長處測定吸光度。80%乙醇溶液代替相應的試劑為對照組。同等條件下測定蘆丁質量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL時的吸光度，并繪制蘆丁標準曲線，得到公式Y=0.0013X-0.0103（R2=0.9921），根據公式計算總黃酮含量。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

1.3.61 DPPH自由基清除能力

參照Xiao Yecheng等[29]的方法測定不同發酵液的DPPH自由基清除活性，并作適當修改。適宜濃度100 μL樣品溶液，加入100 μL DPPH自由基溶液，混勻，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度，其中，以80%乙醇溶液代替DPPH自由基溶液作為對照組。VC和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）為陽性對照。以Trolox為標準品，繪制標準曲線，得到公式Y=-0.0197X＋0.8968（R2=0.9906），計算樣品的Trolox當量，結果以其與第0天發酵液DPPH自由基清除能力的比值表示（相對能力/%）。

1.3.62 ABTS陽離子自由基清除能力

參照Tao Liang等[30]的方法，并作適當修改。將7 mmol/L ABTS和140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光反應12～16 h，制得ABTS陽離子自由基儲備液，后稀釋至其吸光度在734 nm波長處為0.7±0.2，可得ABTS陽離子自由基工作液。取50 μL適宜濃度的樣品溶液于酶標板中，加入200 μL ABTS陽離子自由基工作液，室溫避光反應6 min后于734 nm波長處測吸光度。VC和BHT為陽性對照。其中，以80%乙醇溶液代替ABTS陽離子自由基溶液作為對照組。以Trolox為標準品，得到公式Y=-0.0089X＋0.7406（R2=0.9933），根據公式計算，計算樣品的Trolox當量，結果以其與第0天發酵液ABTS陽離子自由基清除能力的比值表示（相對能力/%）。

1.3.63 鐵離子還原能力

參照Xu Xiaoyan等[31]的方法測定樣品的鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）。分別配制30 mmol/L pH 3.6的乙酸緩沖溶液、10 mmol/L TPTZ工作液及20 mmol/L的FeCl3溶液，將3 種溶液以體積比10∶1∶1混勻即得到FRAP工作液。取50 μL樣品溶液于酶標板中，加入250 μL FRAP工作液，37 ℃水浴恒溫10 min后在593 nm波長處測定吸光度。其中，80%乙醇溶液代替FRAP工作液作為對照組。同等條件下測定硫酸亞鐵的吸光度，繪制標準曲線，得到公式Y=0.0056X＋0.0206（R2=0.9929），根據公式計算，結果以其與第0天發酵液相應FRAP的比值表示（相對能力/%）。

1.3.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測定

參照Amirah等[32]的方法，略修改。50 μL樣品溶液中加入25 μL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液（磷酸緩沖液配制），37 °C水浴恒溫10 min，后加入50 μL 5 mmol/L PNPG溶液，37 ℃下水浴恒溫15 min后，加入100 μL 0.2 mol/L碳酸鈉溶液終止反應，并在405 nm波長處測定吸光度（A）。其中，以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶溶液作為對照組（A0），以80%乙醇溶液代替樣品溶液作為空白對照（A1）。以阿卡波糖為陽性對照。按下式計算α-葡萄糖苷酶抑制率：

1.3.8 代謝組學分析

米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉和魯氏毛霉發酵后，綜合比較三七葉化學成分和體外抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶能力的變化情況，并篩選得到對功能活性增效最強的菌株，對該菌株發酵后的代謝物做進一步分析。

代謝物提取[33]：樣品置于4 ℃解凍后吸取3 mL液體樣品于離心管中，凍干后加入1 mL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）混勻，冰浴超聲30 min，于-20 ℃靜置2 h，然后于4 ℃、16000×g離心20 min，取上清液。將上清液在高速真空濃縮離心機中揮干，加入100 μL甲醇-水溶液（1∶1，V/V）復溶，4 ℃、20000×g離心20 min，取上清液用于質譜分析，同時從每個樣品中取等體積樣品，混勻制備QC樣品，以驗證系統的穩定性和可重復性。

超高效液相色譜條件[34]：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量4 μL。整個分析過程樣品一直置于4 ℃自動進樣器中。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫過程Table 1 Gradient elution procedure

質譜條件[35]：樣品采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）進行正離子和負離子模式檢測。噴霧電壓正離子模式為3800 V，負離子模式為3200 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；母離子掃描范圍為m/z7～1050。

數據處理：原始數據采用MSDIAL軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結構鑒定采用精確質量數匹配（質量偏差＜0.02‰）和二級譜圖匹配（質量偏差＜0.02 Da）的方式，檢索HMDB、MassBank等公共數據庫及自建數據庫。對提取得到的數據，刪除組內缺失值＞50%的離子峰；對正負離子數據分別進行總峰面積歸一化，整合正負離子峰并應用R軟件進行模式識別，數據經Unit variance scaling預處理后，進行后續數據分析。

1.4 統計分析

所有實驗3 次重復，使用Origin 2018和SPSS進行數據統計、分析、繪圖。P＜0.05，差異顯著。利用OmicStudio云平臺（https://www.omicstudio.cn/tool）和歐易集團云平臺（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進行熱圖、火山圖、相關性以及主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 發酵對總皂苷含量的影響

由圖1可知，不同菌株對三七葉總皂苷的影響存在顯著差異，其中隨著發酵時間的延長，米根霉、粗糙脈孢菌和魯氏毛霉發酵的三七葉皂苷含量均呈現先降低后升高然后又降低的趨勢，而紅曲霉則是先降低后升高。除米根霉外的3 種真菌發酵后的總皂苷含量均低于未發酵樣品，原因可能是由于皂苷發酵過程中轉化成了稀有人參皂苷，導致總皂苷含量降低[36]。陳紅惠等[12]同樣發現黑曲霉發酵可使三七葉中皂苷含量先增加后下降，原因是極性較低的稀有皂苷含量有所增加。閆炳雄等[37]報道了黑曲霉可以高效地轉化三七藥材中的皂苷類成分，且伴有幾種稀有人參皂苷和三七皂苷的生成。而米根霉發酵4 d后，其總皂苷含量從未發酵的170.19 mg/g增加到187.31 mg/g，原因可能是三七葉木質部細胞的細胞壁被米根霉產生的某些纖維素酶水解，提高了皂苷提取率[38]。

圖1 真菌發酵對總皂苷含量的影響Fig.1 Effect of fungal fermentation on total saponin content

2.2 發酵對總多糖含量的影響

如圖2所示，隨著發酵時間的延長，4 種真菌發酵后的總多糖含量均明顯降低，其原因可能是微生物在生長過程中，需要不斷地消耗多糖等營養物質[36]。進入發酵后期，菌種活力下降，減少了對糖類的利用[39]。與梅玉立等[40]研究結果一致。

圖2 真菌發酵對多糖含量的影響Fig.2 Effect of fungal fermentation on polysaccharide content

2.3 發酵對總酚和總黃酮含量的影響

由圖3可知，米根霉、粗糙脈孢菌和紅曲菌在發酵7～10 d后使三七葉的總酚含量分別提高40.4%、17.66%、8.1%；而魯氏毛霉發酵卻使三七葉總酚含量顯著下降。經研究發現，不同菌種、發酵時間和發酵方式會造成發酵前后總酚含量的不同[41-42]。張媛媛等[11]研究發現三七葉茶經凝結芽孢桿菌發酵后，其醇提物的總酚和總黃酮含量顯著降低。陳紅惠等[12]研究發現三七葉發酵茶經黑曲霉發酵后，其多酚含量顯著降低，黃酮含量在發酵第15天達到最大值。

此外，米根霉和魯氏毛霉在發酵1～2 d后使三七葉的總黃酮含量分別提高8.66%和17.11%；而粗糙脈孢菌和紅曲霉發酵后，三七葉的總黃酮含量顯著降低。米根霉和魯氏毛霉發酵三七葉后其總黃酮的含量顯著升高，原因可能是米根霉和魯氏毛霉在發酵過程中產生的水解酶降低了淀粉、纖維等高分子對活性成分的包裹作用，有利于黃酮類物質的溶出[43]。粗糙脈孢菌和紅曲霉發酵三七葉后其總黃酮的含量顯著降低，這與發酵過程中三七葉的某些黃酮類成分轉化有關。

2.4 發酵對體外抗氧化活性的影響

考慮到抗氧化機制的復雜性，采用DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP綜合評價其體外抗氧化活性。如圖4所示，米根霉、粗糙脈孢菌、紅曲霉發酵后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP呈先降后升的趨勢，而魯氏毛霉發酵后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP呈先降后平緩的趨勢。4 種真菌發酵3～5 d均可顯著增強三七葉的抗氧化活性，但不同菌株之間作用不一。對增效作用進行分析比較，發現紅曲霉發酵3～10 d后，三七葉的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP分別提高14.30%、29.46%、18.40%，顯著高于其他菌株。其中，三七葉的DPPH自由基清除能力和FRAP在紅曲霉發酵3 d后效果顯著，ABTS陽離子自由基清除能力在紅曲霉發酵3 d后提高5.13%，但顯著低于發酵10 d后。真菌發酵可以增強抗氧化活性，與凌阿靜等[44]研究結果相似。

圖4 真菌發酵對抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of fungal fermentation on antioxidant activity of P. notoginseng leaves

2.5 發酵對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖5可知，4 種真菌在發酵前期均降低了三七葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性，但隨著發酵時間的延長，對α-葡萄糖苷酶抑制活性有所增強。米根霉、粗糙脈孢菌和魯氏毛霉發酵后，三七葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性影響不明顯，而紅曲霉發酵6 d后，三七葉對α-葡萄糖苷酶的抑制活性提高16.03%，明顯高于其他菌株。這與王丹等[45]的研究結果一致，紅曲霉發酵可以提高α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，紅曲霉是增強α-葡萄糖苷酶抑制活性較合適的菌株。

圖5 真菌發酵對抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of fungal fermentation on α-glucosidase inhibitory activity

2.6 代謝組學分析

基于前面的實驗結果，紅曲霉發酵對三七葉的功能活性增效最好，因此采用非靶向代謝組學分析紅曲霉發酵3 d后三七葉中代謝物的變化。

2.6.1 代謝物分類

從三七葉中共鑒定出573 種代謝物，其中正離子模式下檢測到380 種，負離子模式下193 種，如圖6所示。其中，顏色代表分類，面積代表分類中代謝物的相對比例。三七葉中的代謝物在超類水平上主要包括脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物；在類水平上主要包括羧酸及其衍生物、有機氧化合物、丙烯醇脂質；在亞類水平上以氨基酸、肽和類似物為主。

圖6 正（A）、負（B）離子模式下的代謝物分類Fig.6 Classification of metabolites identified in positive (A) and negative (B) ion modes

2.6.2 代謝物的相關分析

根據代謝物的主成分分析（principal component analysis，PCA），如圖7A所示，三七葉和發酵三七葉在正、負離子模式下分布距離較遠，表明發酵前后的代謝物種類和含量有顯著差異。正負離子模式下樣品點集中，表明樣品重復性好。根據P＜0.05和|log2倍數變化（fold change，FC）|≥1.5構建火山圖，如圖7B所示，正離子模式下代謝物有380 種，其中28 種顯著上調，63 種顯著下調；負離子模式下代謝物有193 種，其中顯著上調的有24 種，顯著下調的有46 種。綜上，正負離子模式下上調的代謝物均明顯少于下調的代謝物。

圖7 代謝物的相關分析Fig.7 Correlation analysis among metabolites

根據正交偏最小二乘判別分析獲得的投影中變量重要性（variable importance in projection，VIP）值，選擇VIP值排在前50的差異代謝物繪制聚類熱圖，如圖7C所示。結果發現發酵前后變化的代謝物主要集中在氨基酸、生物堿、碳水化合物、脂類、酚類、類黃酮以及一些萜類化合物等。在發酵過程中，三七葉中的蛋白質發生部分水解，促進氨基酸形成；而氨基酸能與可溶性糖等產生反應，生成新物質；同時三七葉中的黃酮苷也可以被降解成黃酮苷元和糖體。總之，三七葉在發酵過程中發生復雜的代謝反應，也是發酵后三七葉化學成分變化的原因。

2.6.3 差異代謝物與功能活性的相關性分析

將功能活性與代謝物之間進行Spearman相關性分析，如圖8所示。在正、負離子模式下，只有少量代謝物與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著相關，這些代謝物所屬類別較多，這意味著發揮功能活性是各種代謝物協同作用的結果，而不是單一作用。

圖8 功能活性與代謝物的相關性Fig.8 Correlation between functional activity and metabolites

2.6.4 皂苷類化合物分析

由于皂苷被認為是三七中最主要的活性成分之一，因此針對代謝物中的皂苷類化合物進行分析。紅曲霉發酵三七葉發酵前后代謝物中的皂苷類化合物如表2所示，共鑒定到21 種皂苷類化合物，其中正離子模式下10 種，負離子模式下11 種，并發現其中9 種皂苷類化合物經發酵后含量發生了顯著變化。由圖9可知，人參皂苷F2顯著上調，其余皂苷顯著下調。其中，人參皂苷F2是由楊秀偉等[46]從人參莖葉中鑒定出來的稀有皂苷。研究表明，稀有人參皂苷具有較好的藥理活性，如人參皂苷C-K具有抗結直腸癌、抗炎作用[47]；人參皂苷F2是原人參二醇型皂苷如Rb1、Rb2、Rc和Rd等失去若干糖而代謝降解形成的次級皂苷之一[48-49]，被證明具有抗氧化、降脂等生物活性[50]。稀有人參皂苷因含量低而受到限制，利用生物轉化法對普通人參單體皂苷進行結構修飾是獲得稀有人參皂苷的重要途徑[51]。陳旸等[52]發現植物乳桿菌發酵人參后，人參Rd含量顯著提高，Rd作為稀有人參皂苷轉化過程中的中間產物，其作用極為重要。而依據上述總皂苷含量實驗結果，推測出三七葉在發酵過程中同樣存在著皂苷類物質的轉化。

圖9 9 種皂苷類化合物含量的變化Fig.9 Changes in contents of nine saponins

表2 三七葉發酵前后代謝物中的皂苷類化合物Table 2 Saponins in metabolites of raw and fermented P. notoginseng leaves

2.6.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析

對差異代謝物參與的通路進行KEGG富集分析，結果如圖10所示。圖中C（細胞過程）、E（環境信息處理）、G（遺傳信息處理）、H（人類疾病）、M（新陳代謝）、O（生物體系統），圓圈大小表示注釋到該通路中的差異代謝物數量，圓圈顏色越藍越顯著。由于本實驗研究三七葉在發酵過程中的代謝物變化，因而針對M（新陳代謝）進行分析。嘌呤代謝、嘧啶代謝、類黃酮生物合成、輔助因子的生物合成等是紅曲霉在發酵三七葉過程中最可能的代謝通路，其富集到的差異代謝物數量分別為5、4、4 個和6 個。其中，嘧啶代謝往往與氨基酸代謝緊密聯系，如5-甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶會參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；輔助因子是碳代謝與能量代謝的中心代謝物，對氨基酸代謝、脂類代謝、植物次生代謝等有重要作用。

3 結論

真菌發酵對三七葉中的皂苷、多糖、總酚和總黃酮含量有較大的影響，其中皂苷和多糖含量在發酵后顯著降低，而總酚與總黃酮含量在不同真菌中差異較大，原因可能是三七葉中皂苷和多糖含量較高，而總酚和總黃酮含量較低。真菌發酵對三七葉的功能活性有一定的影響，4 種真菌的抗氧化活性在發酵3～5 d后明顯增強，其中紅曲霉發酵3 d后，三七葉的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP分別提高14.30%、5.13%、18.40%；相比其他真菌，其增效作用更顯著。此外，隨著發酵時間的延長，發酵對α-葡萄糖苷酶抑制活性有所增強，其中紅曲霉發酵6 d后增強16.03%，在4 種真菌發酵中增效作用最大。通過上述結果可得，紅曲霉發酵3 d后，對三七葉的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的增效作用較顯著，因此選擇紅曲霉作為本研究中最適宜發酵三七葉的菌株。有趣的是，三七葉中含有豐富的纖維，但本研究選用的分解纖維素能力較強的兩株菌株（粗糙脈孢菌、魯氏毛霉菌）并非是對三七葉功能活性增效最明顯的菌株，原因可能是三七葉除了富含纖維外，也含有豐富的多糖、蛋白質、維生素、礦物質、氨基酸等營養成分，而這些營養成分可以被真菌所利用，產生具有各種功能活性的次生代謝產物。

進一步的非靶向代謝組學分析揭示了三七葉在發酵過程中代謝物的變化，發酵后上調的代謝物明顯少于下調的代謝物，主要集中在氨基酸、生物堿、碳水化合物、脂類、酚類、類黃酮以及萜類化合物等，這些代謝物可能作為三七葉發酵的底物，被逐漸氧化消耗，意味著這些代謝物可能參與三七葉發酵的過程。對其中的21 種皂苷類化合物進行進一步分析，發現其中只有人參皂苷 F2顯著上調，另有8 種皂苷顯著下調。且只有少量代謝物與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著相關。通過KEGG富集分析發現嘌呤代謝、嘧啶代謝、類黃酮生物合成、輔助因子的生物合成等是紅曲霉在發酵三七葉過程中最可能的代謝通路，這解釋了紅曲霉發酵三七葉后功能活性發生變化的原因，揭示了其代謝途徑。本研究基于代謝組學技術研究了發酵過程中的差異代謝物以及皂苷類化合物的變化情況，并初步推測了其可能的代謝途徑。然而，由于發酵過程復雜，對其代謝機制的研究仍需深入探討。此外，本研究是在同樣的條件下利用不同真菌對三七葉進行發酵，在今后的研究中可對不同菌株的發酵條件進行優化，以提高菌株的發酵能力。同時進一步對三七葉中皂苷的發酵轉化進行深入研究，為三七稀有皂苷的生物轉化機制提供思路。以期為三七葉的開發利用提供理論依據。