基于二代測序技術的玉米內標準基因擴增子的篩選與評估

陳利紅，周俊飛，梁晉剛，李甜甜，王顥潛，方治偉，陳 紅,*，彭 海,*

（1.江漢大學生命科學學院，湖北 武漢 430056；2.農業農村部科技發展中心，北京 100176）

玉米（Zea mays）是世界三大糧食作物之一，也是重要的飼料作物，是世界農業生產中的重中之重。玉米產業的健康發展對保障國家糧食安全和農產品有效供給具有重要意義[1]。目前玉米已成為我國面積最大、總產最多的作物，但是玉米生長過程中極易受到外界環境及各種病蟲害的干擾，嚴重影響其品質和產量[3]；而傳統的雜交育種技術因耗時長、效率低、需要大量人力物力，已經難以滿足玉米產業快速發展過程中對優良品種的迫切需求[2]。因此人們開始利用基因工程手段將外源基因導入玉米中，以提高玉米對環境與病蟲害的耐受性。然而轉基因技術在生產中產生巨大經濟效益與社會效應的同時，其安全問題也引起了人們的廣泛關注[3-4]。為了充分保障消費者的知情權，各個國家與組織機構要求企業對生產的轉基因產品進行標識[5]。目前國際上對于轉基因標識的管理主要分為四大類：一是如美國、加拿大、阿根廷等國家采取自愿標識；二是如歐盟[6]、巴西等國家實行定量全面強制標識[7]，即對所有產品只要其轉基因成分含量超過一定的閾值就必須標識；三是如日本采取定量部分強制性標識，即對特定類別產品實行超過規定的閾值就必須標識，四是如我國是采取定性按目錄強制標識，即凡是列入目錄的產品，只要含有轉基因成分就必須標識。

轉基因產品“標識閾值”的實施尤其需要對樣品中的轉基因成分進行定量檢測[8]。在轉基因定量檢測過程中，需要對樣品基因組DNA含量或拷貝數目、轉入外源基因的拷貝數目進行計算，進而獲得樣品的轉基因含量，這個過程需要對植物的內標準基因與轉入的外源基因進行有效擴增。因此內標準基因對樣品轉基因成分的定性定量檢測顯得尤為重要，其擴增區域、擴增效果將直接影響轉基因成分檢測的準確性[9]。對于轉基因農產品的檢測，內標準基因是指植物中具有種內非特異性、種間特異性與基因組上拷貝數低且拷貝數恒定的一類基因，這類基因在不同品種（品系）之間異質性低[9]。轉基因植物及其相關農產品的成分來源、實驗系統的可靠性與穩定性、混合樣品中的轉基因含量的計算均需通過對內標準基因的檢驗實現[10-12]，因此內標準基因及其擴增區域的篩選對于獲得可靠的實驗結果至關重要。

目前，已有多個內標準基因用于轉基因植物的實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）檢測系統中，如水稻（Oryza sativa）的蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase，SPS）[13]、根部表達基因（rice root-specific gene，gos9）[14]、磷脂酶D基因（phospholipase D，PLD）[8]、磷酸果糖激酶基因（ppi phosphofructokinase，ppi-PPF）[9]，玉米的轉化酶基因（invertase，IVR）[15]、醇溶蛋白基因（zein）[16]、玉米淀粉合成酶II（Zea maysstarch synthase isoform zSTSII-2，zSSIIb）[17]、乙醇脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase，ADH1）[15]、高遷移率族蛋白基因（high mobility group protein，HMG）[18]，大豆（Glycine max）的凝集素基因（lectin）[19]、熱休克蛋白基因（heat shock proteins，HSP）[20]，小麥（Triticum aestivum）的乙酰輔酶A羧化酶基因（acetyl-CoA carboxylase，ACC1）[21]，還有其他物種的泛素結合酶基因（ubiquitin-protein ligase，E3-UBI）[22]等。近年來全球范圍內轉基因生物（genetically modified organisms，GMO）和未授權的GMO數量日益增多，特征也越來越多樣化，給現在轉基因檢測金標準real-time PCR檢測技術帶來了巨大的挑戰。如傳統的real-time PCR技術一次只能實現檢測一個靶標，需要多次擴增和檢測才能滿足多靶標轉基因成分檢測的需求，而新興的二代測序技術彌補了該傳統技術的缺陷[22-27]，顯著提高了檢測效率。目前尚鮮見基于二代測序技術的玉米內標準基因擴增子篩選、評估方面的研究與報道。本研究基于現有文獻中報道的玉米、水稻、大豆等植物中的內標準基因及其定義，從玉米基因組中選擇7 個候選內標準基因，共設計13 個擴增區域（擴增子），利用二代測序技術對這些內標準基因的擴增子進行種內一致性、種間特異性等系統性評估，進而為后續利用二代測序技術對轉基因玉米的定量檢測提供合適的內標準基因擴增子。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的208 個常規玉米品種或品系（表1）由農業農村部科技發展中心提供。其他非玉米物種水稻（5 個樣品）、棉花（Gossypiumspp.，3 個樣品）、大豆（4 個樣品）、花生（Arachis hypogaea，1 個樣品）、西瓜（Citrullus lanatus，2 個樣品）、黃瓜（Cucumis sativusL.，2 個樣品）、甜瓜（Cucumis melo，2 個樣品）、番茄（Lycopersicon esculentum，2 個樣品）、辣椒（Capsicum annuumL.，2 個樣品）、白菜（Brassica pekinensis，2 個樣品）的DNA為本實驗室保存。

表1 常規玉米品種（品系）信息Table 1 Information about common maize varieties (lines) tested in this study

多重擴增建庫試劑盒（GP000505）石家莊博瑞迪生物技術有限公司；植物D N A 提取試劑盒（DP320）、λDNA/HindIII Marker、DNA Marker I、D2000 DNA Marker 北京Tiangen生化科技有限公司；Qubit dsDNA檢測試劑盒（Q33230）美國Thermo Fisher公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Nanodrop 2000微量紫外分光光度計、Qubit 4.0核酸定量儀、Qubit 2.0熒光計 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與定量

待檢樣品葉片用液氮充分研磨后，用天根植物DNA提取試劑盒（DP320）按照其說明書進行基因組DNA提取。用Qubit 4.0核酸定量儀檢測DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量。

1.3.2 內標準基因的選擇與引物設計

根據文獻中或者國家標準中報道的常用內標準基因、內標準基因的定義及玉米基因組序列，本研究共選擇7 個候選基因用于后續研究。引物設計與合成由博瑞迪生物技術有限公司完成。引物信息見表2。

表2 研究所用的引物及其相關信息Table 2 Information about primers used in this study

1.3.3 擴增子文庫構建與測序

按照石家莊博瑞迪生物技術有限公司的建庫試劑盒GenoPlexs Multiplex-PCR Library Prep Kit for MGI說明書（GP000505）進行建庫，具體過程如下：取50～200 ng基因組DNA（穩定性和檢出豐度比較分析所用的樣品DNA起始量均是200 ng/樣品，其他的樣品若DNA量足夠的話，也盡量使每個樣品的起始DNA量為200 ng），用設計的多重引物對樣品中目標序列進行第1輪PCR擴增。擴增體系為30 μL，多重擴增引物（每條引物0.2 μmol/L）：4 μL，基因組DNA：50～200 ng，GenoPlexs 3×T Master Mix：10 μL，用ddH2O補足到30 μL，然后按照表3進行PCR擴增。其擴增產物用磁珠法進行目標片段篩選后再進行第2輪PCR擴增，第2輪擴增時為每個樣品加上不同的測序條形碼（Barcode）。擴增體系為30 μL，GenoPlexs 3xT Enzyme mix：10 μL，P5 Barcode：2 μL，P7 Barcode：2 μL，ddH2O：16 μL，按照表4進行擴增。最后純化獲得擴增子建庫文庫，該建庫過程經過適當調整以匹配Illumina平臺，文庫經質檢合格后進行測序。文庫質檢首先用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用Qubit對文庫濃度進行檢測，符合文庫片段大小及文庫質量濃度在10 ng/μL以上由南京諾禾致源生物信息科技有限公司進行PE150測序（NovaSeq 6000）。

表3 文庫構建的第1輪PCR擴增條件Table 3 Conditions of first round of PCR amplification for library construction

表4 文庫構建的第2輪PCR擴增條件Table 4 Conditions of second round of PCR amplification for library construction

1.3.4 普通PCR驗證

對zSSIIb-1擴增子檢出reads數目高低不一的8 個樣品（M000265、M019298、M019325、M019314、M000036、M016228、M019142和M019143）進行普通P C R 驗證，P C R 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增體系20 μL，zSSIIb-1上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、基因組DNA 20 ng，2×Prime Star GC Buffer 10 μL、2.5 mmol/L的dNTP mix 2 μL、TaKaRa Prime StarTaq酶0.2 μL用ddH2O補足到20 μL，然后按照表5進行PCR擴增。大豆lectin基因是以大豆4 個樣品文庫構建的第1輪PCR產物為模板（0.5 μL），利用文獻[19]報道的大豆lectin內標準基因的引物（F：TGGGACAAAGAAACCGGTAG，R：GTCAAACTCAACAGCGACGA，擴增長度201 bp）及PCR擴增條件進行擴增與電泳檢測。其中，zSSIIb-1擴增子與lectin內標準基因的PCR驗證均以H2O作為空白對照。

表5 zSSIIb-1基因普通定性PCR條件Table 5 Conditions for qualitative PCR amplification of the zSSIIb-1 gene

1.3.5 測序數據分析

下機的測序數據經過以下幾個步驟分析進而獲得歸一化的內標準基因擴增子測序序列數目，1）根據Barcode序列和各擴增子引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，Illumina接頭序列使用Cutadapt v1.8.1去除；2）使用FLASH（V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對每個樣品的reads進行拼接，得到拼接序列，其中拼接成功與未拼接成功的序列統稱為原始Tags數據（Raw Tags）；3）將這些原始的Raw Tags，利用FASTXtoolkit v0.014（http://hannonlab.cshi.edu/fastx_toolkit）去除低質量的序列（序列質量Q20值＜20），得到高質量的Tags數據（Clean Tags）；4）將Clean Tags比對到玉米參考基因組序列上，并確定每個擴增子的原始reads數目；5）最后把所有樣品按照測序1000000 條reads，每個內標準基因200 bp長度進行歸一化處理，進而獲得每個樣品中每個擴增子的測序reads數目，即為每個擴增子的檢出豐度。單個樣品中每個擴增子若有一條測序read檢出，則認為該擴增子在此樣品中被檢出，每個擴增子的檢出率為該擴增子檢出樣品的數目占所有樣品中的百分比。

1.3.6 內標準基因擴增子的種內一致性、種間特異性、保守性、穩定性與動態檢測范圍分析

分別用208 個常規玉米樣品與10 個非玉米物種進行內標準基因擴增子的種內一致性與種間特異性評估。種內保守性是通過分析這些內標準基因擴增子在所測試的208 個常規玉米樣品中的拷貝數目及單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）數目進行評估。然后用建庫DNA起始量相等的25 個常規玉米測試所選內標準基因擴增子的穩定性，利用geNorm[28]和NormFinder[29]分析軟件并參考相關文獻[30-31]對這些擴增子進行評估，其中，最優內標準基因擴增子數量采用geNorm軟件對配對擴增子變異系數進行分析完成。內標準基因擴增子的動態檢測范圍分析按照以下步驟進行，將5 個常規玉米品種（未知1、四單154、承單15、鐵D9125和未知2）的DNA（每個樣品起始DNA量為200 ng），依次稀釋1、50、100、500 倍和1000 倍進行文庫構建與測序分析以獲得每個內標準基因各擴增子的檢出豐度，進而確定所篩選的內標準基因各擴增子的動態檢測范圍。

2 結果與分析

2.1 所選內標準基因的引物設計與拷貝數分析

根據文獻中或者國家標準中報道內標準基因及其定義，共篩選7 個內標準基因，分別為zSSIIb、zein、ADH1、IVR、HMG、E3-UBI和HSP70。為了確定同一個內標準基因不同的擴增區域是否對其檢出有影響，每個內標準基因擬計劃設計2 對引物。設計結果顯示除了IVR只設計出 1對引物外（該基因設計的另外一對引物和引物組的其他引物容易形成二聚體），其他基因均設計出2 對引物，因此共有13 個擴增子區域。利用在線BLAST程序對這7 個內標準基因的13 個擴增子進行拷貝數分析，發現這些內標準基因的13 個擴增子在玉米基因組上均只有1 個拷貝（表2）。

2.2 種內一致性、檢出豐度與種間特異性分析

通過對待檢的208 個玉米樣品進行建庫、測序與分析，發現IVR（京BD123096、京BD122945）與HSP70-1擴增子（雅玉98和增玉1572）均只有兩個樣品沒有被檢出（圖1），檢出率為99.0%；zein-2擴增子在11 個樣品中（偉科7、京BD123096、京BD122314、京BD121602、京BD124360、京H113417、京H101662、京BD122945、錦華336、冀植選3和高誘2號）沒有被檢出，檢出率為94.7%；而剩余的10 個擴增子在所有樣品中均有不同豐度的檢出，檢出率為100%；說明這些擴增子在玉米種內的一致性均較好。

圖1 13 個擴增子在208 個樣品中的檢出率（A）與檢出豐度（B）Fig.1 Detection rates (A) and abundance (B) of 13 amplicons in 208 samples

此外用建庫起始DNA量相等（200 ng）的25 個玉米品種對所選7 個內標準基因的13 個擴增子進行檢出豐度分析。結果顯示每個內標準基因的各擴增子在所有樣品中均被檢出（圖2），同一個內標準基因，除了ADH1內標準基因的兩個擴增子ADH1-1和ADH1-2檢出豐度相對比較接近外，其他5 個內標準基因的2 個擴增子檢出豐度均有一定差異，說明同一個內標準基因的不同擴增子檢出豐度有差異。在13 個擴增子中，zSSIIb-1檢出豐度最高，其次為E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，它們檢出豐度均變異較大，而zein-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-2、E3-UBI-2與HSP70-1的變異較小（標準偏差均在100以內）。從檢出率及檢出豐度高低看，zSSIIb-1作為內標準基因相對較好，但其在各樣品的檢出豐度變異較大。為了驗證豐度變異較大的zSSIIb-1擴增子在普通瓊脂糖電泳圖上的目標條帶亮度是否差異較大，用zSSIIb-1引物對檢出豐度高低不一的8 個樣品進行普通PCR驗證，發現zSSIIb-1檢出豐度在2000～3000 條reads的樣品，其PCR產物在瓊脂糖凝膠上的條帶亮度差異并不大（圖3），因此直接通過瓊脂糖電泳圖無法精準確定各擴增子的檢出豐度。

圖2 13 個擴增子在建庫DNA起始量相等的25 個樣品中的檢出豐度箱線圖及散點圖Fig.2 Boxplot and scatter plot of the detected abundance of the 13 amplicons in 25 samples with equal initial amount of DNA for library construction

圖3 玉米zSSIIb-1擴增子在8 個樣品中的檢出豐度（A）及定性PCR驗證（B）和大豆lectin基因的PCR驗證（C）Fig.3 Detected abundance of zSSIIb-1 amplicon (A) and qualitative PCR validation (B) in eight samples,and PCR validation of soybean endogenous reference gene lectin (C)

利用其他非玉米樣品如水稻（5 個樣品）、棉花（3 個樣品）、大豆（4 個樣品）、花生（1 個樣品）、西瓜（2 個樣品）、黃瓜（2 個樣品）、甜瓜（2 個樣品）、番茄（2 個樣品）、辣椒（2 個樣品）、白菜（2 個樣品）10 個非玉米物種的25 個樣品，對這些內標準基因的擴增子進行種間特異性評估，結果發現這25 個樣品均未建庫成功，理論上來講這是由于建庫所用的引物是針對玉米內標準基因特異設計而造成。為了排除建庫的問題，以大豆4 個樣品的第一輪PCR產物為模板，利用文獻報道的大豆內標準基因引物進行PCR擴增與電泳檢測，結果發現大豆的4 個樣品均能擴增出lectin基因的目標條帶，排除了建庫的問題，充分說明了所選內標準基因擴增子的種間特異性。

2.3 種內保守性分析

通過測序分析每個內標準基因的擴增子序列，可以獲得每個擴增子在各樣品中的拷貝數目是否和理論值一致，同時確定其是否含有SNP或者插入缺失序列（insertion-deletion，InDel）。分析結果顯示：這7 個內標準基因的13 個擴增子在各樣品中的拷貝數目確實和理論值一致，均只有一個拷貝。zein-1與IVR既含有SNP也含有InDel，而E3-UBI-1與之相反，兩者均無，HMG-2只含有1 個InDel，剩余的其他擴增子序列均含有1～11 個SNP（表6）。內標準基因應選擇種內保守性較好的基因，如本研究E3-UBI內標準基因的E3-UBI-1擴增子。對于含有較密集SNP或者InDel的擴增子，若后續研究用其作為內標準基因并自己設計引物時，不僅要考慮擴增子的長度，還需注意避開這些SNP或者InDel位置，以免影響其擴增效率或檢出率。如本研究中的IVR，其擴增長度較長263 bp，內部又含有SNP和InDel，可能是導致其檢出豐度較低、穩定性差的原因。

表6 內標準基因擴增子保守性分析的相關參數Table 6 Parameters of intraspecies conservation of amplicons of endogenous reference genes

2.4 穩定性分析

2.4.1 geNorm分析內標準基因擴增子的穩定性

geNorm軟件通過計算每個內標準基因在不同樣品中檢出豐度的穩定性值（M值）確定其穩定性，M值越小說明內標準基因的穩定性越高，反之則越低。geNorm軟件通常會將穩定性M值低于1.5的基因作為內標準基因。利用geNorm軟件對所篩選的7 個內標準基因的13 個擴增子的穩定性進行分析。結果顯示這7 個內標準基因的13 個擴增子的M值均小于1.5，說明它們均可選為內標準基因（圖4），其中最穩定的是擴增子ADH1-1與ADH1-2，最差的是IVR。

圖4 geNorm分析13 個擴增子的穩定性（A）及其最佳配對數目（B）Fig.4 Analysis of stability (A) and optimal pair number (B) of 13 amplicons using geNorm

geNorm軟件還可通過計算內標準基因的配對變異系數（pairwise variation value，Vn/Vn+1）確定內標準基因的最佳數目。通常以0.15作為臨界值確定內標準基因的最適數量。如果配對變異系數小于0.15，表明n個內標準基因已經穩定，無需引入第（n＋1）個內標準基因，即能夠滿足相對定量的要求，反之亦然。分析結果表明在測試穩定性的擴增子中，最穩定的兩個擴增子為ADH1-1與ADH1-2，配對變異系數V2/V3小于0.15，表明選擇這2 個擴增子即可滿足定量檢測的需求。

2.4.2 NormFinder分析內標準基因擴增子的穩定性

NormFinder與geNorm類似，也是通過計算內標準基因檢出豐度的M值評價內標準基因的穩定性，M值越小則其穩定性越高。NormFinder分析結果顯示，ADH1-2擴增子的穩定性最高，IVR最差（表7），該結果與geNorm軟件的分析結果一致。此外這兩個軟件的分析結果顯示，M值排序從第8個開始，后面6 個擴增子的排序都一樣。

2.5 內標準基因擴增子的動態檢測范圍

內標準基因的動態檢測范圍分析結果顯示這些內標準基因的擴增子除HSP70-1在1 個樣品（M000036的1000 倍稀釋，DNA總量0.2 ng）中沒有檢出外，其余擴增子在DNA量檢測下限為0.2 ng時，均能被檢出，說明所選內標準基因的檢測靈敏度較高（圖5）。具體地，在所測5 個玉米品種（品系）的各稀釋梯度，IVR、HSP70-1、E3-UBI-2與HMG-2檢出豐度較低（絕大數小于100 條reads），并且這4 個擴增子在各個品種（品系）的不同稀釋梯度的檢出豐度幾乎無差異；與IVR、HSP70-1、E3-UBI-2和HMG-2的相反，zSSIIb-1擴增子的檢出豐度較高（最低為337，平均值1640.852），zein-1、zein-2、zSSIIb-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-1、E3-UBI-1與HSP70-2檢出豐度相對次之，但這9 個擴增子的檢出豐度均不隨樣品DNA的稀釋梯度的變化而成比例變化。這樣進行轉基因成分定量時，選擇不同的內標準基因會呈現不同的檢測結果，尤其對混雜不同物種的轉基因樣品（如食品中混了不同濃度的轉基因玉米和大豆）進行檢測時，定量檢測將變得更復雜，需要聯合幾個內標準基因，并利用標準品設置矯正系數才能對樣品中的DNA含量或轉基因成分進行精準定量。

3 結論

轉基因玉米非常容易通過非法途徑混入我國食品市場，這不僅會對消費者的食用安全造成威脅，還可能會因此擾亂我國在轉基因食品上的監管。轉基因產品的監管、檢測以及作物成分的鑒定均要以內標準基因為基準，因此內標準基因及其擴增區域的篩選與評估顯得尤為重要。到目前為止，已開發的玉米內標準基因有ADH1[15]、IVR[15]、zein[16]、zSSIIb[17]、HMG[18]。zSSIIb是我國轉基因玉米檢測標準中較常用的，而ADH1基因是歐盟轉基因玉米檢測標準中常用的。本研究利用二代測序技術對上述幾個常用的玉米內標準基因及其他植物中報道的兩個內標準基因在玉米中同源物（E3-UBI和HSP70）的擴增子進行了種內一致性、保守性、種間特異性、檢出豐度及動態檢測范圍進行評估。

通過對所選的7 個內標準基因13 個目標擴增區域的高通量測序數據分析發現，這13 個擴增子在208 個樣品中的檢出率為94.7%～100%，而在非玉米的水稻、大豆、棉花、白菜等物種中均無法被有效檢出，說明這些內標準基因的種內高度一致性與種間的高度特異性。其中zSSIIb-1檢出豐度最高，其次為E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，IVR檢出豐度最低，然而zSSIIb-1檢出豐度在各個樣品中變異較大，這可能與設計的擴增子引物區域的保守性、擴增子長度、引物擴增效率及樣品DNA濃度等多種因素有關。其中引物的保守性及擴增子的長度可能對擴增子的檢出豐度影響更大，如本實驗所選的E3-UBI-1擴增子非常保守，既沒有SNP，也沒有InDel，其檢出豐度相對較高；而IVR與之相反，兩者均有，加上測序長度單端只有150 bp，致使IVR在檢測的所有樣品中的檢出豐度均較低，因此建議若后續使用IVR作為內標準基因時，可考慮重新設計引物，并且引物不要設計在含有SNP和InDel的區域，擴增長度短些。

此外，本研究還利用geNorm和NormFinder軟件分析了7 個內標準基因13 個擴增子的穩定性，分析結果均表明最穩定的內標準基因擴增子是ADH1-2，最不穩定的是IVR。動態檢測范圍分析結果顯示，檢出豐度穩定性最好的ADH1-2與種內最保守的E3-UBI-1擴增子在文庫構建的DNA用量檢測下限為0.2 ng時，均還能在樣品中被穩定檢出。因此從種內保守性與檢出穩定性綜合看，利用擴增子測序法對轉基因產品進行檢測時，優選E3-UBI-1與ADH1-2這兩個擴增子相對較好。但具體這些內標準基因擴增子如何組合才能精準定量玉米產品中的轉基因成分，目前研究團隊還在攻關中。