基于羊水脂質組學技術探索大黃對孕鼠生殖及胚胎發育影響*

李思穎，房樺峰，種瑩，徐建亞，單進軍

（南京中醫藥大學中醫兒科學研究所/江蘇省兒童呼吸疾病（中醫藥）重點實驗室 南京 210023）

大黃作為中藥“四大金剛”之一，被廣泛應用于內科、外科、兒科、皮膚科以及婦科等方面。但近年來，關于大黃各項毒性的報道層出不窮。學者們研究發現，大黃蒽醌類化合物（如大黃酸、大黃素）顯示出了肝腎毒性以及生殖發育毒性[1-3]；大黃水提物長期大劑量應用也會產生相關毒性[4]。何秋霞等[5-6]報道，大黃素對斑馬魚胚胎發育具有毒性作用；蘆薈大黃素對未成熟斑馬魚胚胎具有致死作用。本課題組前期研究發現，重復給與大黃水提液（給藥劑量為2 g·kg-1）14天，成年大鼠14天增重都有所降低，特別是雌性大鼠的14天增重及腎臟、子宮系數顯著降低，給藥組雄性大鼠精子數量明顯減少；血清中谷草轉氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）顯著降低。這些研究結果也提示，大黃可能會影響大鼠的生殖功能。大黃被列為妊娠禁忌中藥中的慎用藥，但目前對于妊娠禁忌中藥界定還有很大爭議，沒有一個普遍認可的標準。鑒于中藥是多成分復合體，每種成分的毒性不能完全代表中藥整體的作用效果。基于高通量篩選平臺的研究方法更適合中藥安全性的綜合評價，特別是代謝組學技術為發育毒性中藥的篩查及機制的研究提供了新的手段。羊水能夠反映胎兒的生理或病理狀態，在胚胎發育的相關研究中具有優勢；基于羊水的代謝組學可以更加精確地檢測藥物以及毒物等對胎兒的影響[7]。

關于大黃的毒性研究不少，但目前對大黃水提物的妊娠毒性及胚胎發育毒性的相關研究仍較少，其作用機制尚未明確。

基于此，本課題組通過擬羊水代謝組學的方法探索了大黃對大鼠的生殖發育的影響，討論了孕期大黃用藥的可行性以及大黃作為妊娠禁忌中藥的依據。

1 材料與方法

1.1 動物

10周齡性成熟SD大鼠共30只，體質量300g左右；由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，SPF級；實驗動物合格證號：NO.201900840。飼養環境溫度為（23±2）℃，濕度為（60%±10%），自由飲水進食。動物實驗得到了南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準，遵守實驗動物福利及倫理（動物倫理批件號：201812A008）。

1.2 藥物制備

生大黃飲片，購自江蘇省中醫院藥房。

大黃水煎液的制備：大黃藥材500 g，10倍水浸泡2 h，煮沸10 min，倒出藥液；再加6倍水，煎煮10 min，合并藥液，過濾，低溫濃縮至濃度為0.2 g·L-1備用。

1.3 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS）：溶于超純水中，定容1000 mL，用高壓蒸汽滅菌器滅菌，氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.56 g，磷酸二氫鉀0.1 g，在室溫下冷卻；甲基叔丁基醚（MTBE），購自美國ROE；內部標準：lysoPE（17:1）（批號：LM171LPE-11），SM（17:0）（批號：170SM-13），PE（17:0/17:0）（批號：LM170PE-19）從Avanti Polar Lipids公司購買；冰醋酸（批號：15080553613，純度：99.5%）購自南京化學試劑有限公司。異丙醇、甲酸銨和乙酸銨均為99.8%的純質譜，購自美國ROE公司；甲醇和乙腈為99.8%質譜，購自德國默克公司。

ALLegra64R高速冷凍離心機（Beckman，USA）；Savant SPD1010真空離心濃縮器（Thermo Fisher Scientific，USA）；U3000高效液相色譜儀（Dionex，USA）；Q-Exactive四極桿-靜電場Orbitrap高分辨率質譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）；Xcalibur 2.1SP1數據處理系統（Thermo Fisher Scientific，USA）。

1.4 分組及給藥

性成熟SD大鼠（雌性20只，雄性10只），適應性飼養1周后，每天20：00，雌、雄鼠（2:1）合籠交配，次日8：00，精子涂片，見精子者確定為已交配，定為妊娠0天（GD0）。確認交配的雌鼠隨機分成空白對照組（CK組）和大黃水提物組（DH組），每組8只。大黃水提物組按每100 g體質量1 mL藥液，于GD6-16天灌胃給藥每日給藥1次，劑量為2 g·kg-1體質量；空白組給予等體積飲用水。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 一般狀態觀察

給藥期間觀察孕鼠的活動、有無陰道出血或者流產等現象。

1.5.2 指標檢測

孕大鼠于GD17麻醉后取血，血清樣本隔日送至南京市東南大學中大附屬醫院檢測谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、肌酐（Cr）以及尿素氮（BUN）的含量。解剖后采集母鼠的心臟、肝臟、腎臟、卵巢及胎盤用于病理檢測，組織經10%福爾馬林固定；48 h后送檢，常規石蠟包埋，切片厚4-5 μm，HE染色，病理專業人員閱片，根據病變輕重程度，依次半定量為極輕度“±”、輕度“+”、中度“++”、重度“+++”而無病變組織標記為“-”。取羊水用于脂質組學檢測；同時記錄活胎數、吸收胎、早死胎（晚死胎），三者總和計數為胚胎植入數。采用誘導低溫法處死活胎后，逐個測量體質量，鑒定外觀畸形。實驗結束后分別統計各組母體受孕率，胎仔活胎率、吸收胎率、早死胎率、平均活胎體質量以及外觀畸形率。

1.5.3 羊水代謝組學檢測

（1）羊水LC-MS前處理

500 μL羊水凍干后，用200 μL或160 μL純凈水復溶。復溶后羊水取80 μL于1.5 mL的離心管中，加入含內標[lyso PE(17:1)，SM（17:0），PE(17:0/17:0)]的冰甲醇溶液225 μL，渦旋10 s，加入冰甲基叔丁基醚（MTBE）750 μL，渦旋10 s后于4℃震蕩10 min后加入冰超純水188 μL，渦旋20 s后于4℃，14000 r·min-1離心2 min，吸取上清液35 0μL至1.5 mL的離心管中（上層用于測脂質組）；取下層水相110 μL至1.5 mL的離心管中（下層備用用于GC-MS法測極性物質）；在離心濃縮儀中真空揮干，放置于-20℃待測。

（2）液相色譜質譜條件

液相色譜質譜條件參考相關文獻[8]為了檢測脂質，通過梯度洗脫將2 μL等份試樣溶液注入維持在60℃的反相Waters Acquity UPLCCSHC18（100 mm×2.1 mm，1.7 m）上。流動相A為水：ACN（6:4），流動相B為異丙醇：ACN（9:1），均含有10 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸。流速為0.3 mL·min-1，洗脫梯度如下：0-4.0 min，15% B；4.0-5.0 min，15%-48% B；5.0-22.0 min，48%-82% B；22.0-23.0 min，82%-99% B；23.0-24.0 min，99% B；24.0-24.2 min，99%-15% B；24.2-30.0 min，15% B。施加的離子源和離子轉移參數如下：噴霧電壓3.5 kV（正）和3.0 kV（負）。對于這兩種電離模式，鞘氣、輔助氣、毛細管溫度和加熱器溫度分別保持在35、15（任意單位），325℃和300℃。

1.6 數據統計

數據采用SPSS 19.0統計軟件進行處理分析。兩組連續性計量數據采用獨立樣本T檢驗比較。Kruskal-Willis H（K）檢驗用于胎仔活胎率，吸收胎率、早死胎率及先天畸形率的分析。其中胎仔體質量的統計檢驗采用嵌套設計（胎仔嵌套于窩，窩嵌套于組）方差分析，即先計算每窩胎仔均數，再以窩均數計算每組均數。數據以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示有統計學差異。

脂質注釋后，建立了一個小型數據庫，其中包含脂質名稱，保留時間（RT）和準確的質荷比（m/z）。使用ABF轉換器（可從http://www.reifycs.com/AbfConverter訪問）將從Xcalibur 2.2軟件（Thermo Scientific）獲得的原始數據文件轉換為ABF格式。對于數據處理，使用了MS-DIAL（V.2.78）軟件程序。在這項研究中，只有定義為m/z-RT對的脂質特征才能針對相同的脂質進行比對。生成的高質量時間校準檢驗脂質的輸出數據表及其相應的RT，m/z和每個樣品的峰面積均經過了進一步的統計分析[8]。

使用MetaboAnalyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca）進行多變量分析。使用基于R語言的LOESS（局部加權回歸）歸一化數據矩陣[9-10]。進行了無偏差主成分分析PCA和偏最小二乘法分析OPLS-DA，并使用置換策略進行了模型評估。通過U檢驗和FDR校準選擇差異脂質，P＜0.05，FDR＜0.4。

2 結果

2.1 孕鼠一般情況

給藥期間孕鼠的活動、行為無異常表現，未發現陰道出血、流產等現象；正常組的3只孕大鼠于GD17解剖前發現已經或者正在生產，可能是前期受孕日判斷有誤。

2.2 孕鼠血清生化指標

如表1所示，與對照組相比，大黃組孕大鼠ALT顯著升高（P＜0.01）；其余各項生化指標與對照組均無顯著性差異。

表1 孕大鼠血清生化結果（±s，n=8）

注：與CK組比較，**P＜0.01。

組別CK組DH組劑量（g·kg-1）-2 ALT（IU·L-1）44.88±7.32 58.00±7.05**AST（IU·L-1）97.14±17.86 114.50±16.43 CK（IU·L-1）473.71±166.66 497.20±187.95 BUNmmol·L-1 4.71±0.87 4.83±0.94 Crμmol·L-1 26.13±2.23 23.63±3.02

2.3 孕鼠組織病理學結果

組織病理學檢查結果表明，與對照組相比，大黃組孕大鼠心、肝、腎、卵巢無明顯的與藥物有因果關系的病理性損傷。但是大黃組兩例胎盤有重度瘀血（圖1），這兩例對應于沒有活胎，只有吸收胎和早死胎的兩只孕大鼠。

圖1 給藥11天后孕鼠胎盤組織病理變化（200×）

2.4 對孕鼠妊娠及胚胎發育的影響

如表2所示，與CK組比較，DH組的活胎數率顯著降低，吸收胎及早死胎率顯著升高（P＜0.05）；DH組窩胎仔體質量也顯著低于CK組（P＜0.01）；外觀畸形率也低于CK組，但無顯著差異。

表2 大黃水提物對大鼠妊娠及胚胎發育的影響（±s，n=8）

表2 大黃水提物對大鼠妊娠及胚胎發育的影響（±s，n=8）

注：與CK組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別CK DH-2 g·kg-1受孕率（%）100%100%著床數104 111活胎數/率（%）104（100%）71（64%）*吸收胎數/率（%）0（0）18（16.2%） *早死胎數/率（%）0（0）22（19.8%） *胎仔體質量（g）0.94±0.06 0.78±0.05**外觀畸形率（%）0 5.6

2.5 羊水代謝組學結果

2.5.1 羊水中脂質成分的分析

對照組和大黃組的樣品通過混合四極桿活性Orbitrap質譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）進行檢測。樣品以正離子和負離子模式隨機分配。使用MS-DIAL軟件和超過200000個MS/MS光譜的LipidBlast數據庫分析了原始數據。圖2A和圖2B分別顯示了在正離子模式和負離子模式下不同時間段的總離子流圖（TIC）。與公共LipidBlast文庫的準確質量數和MS/MS匹配用于脂質注釋和鑒定。

圖2 MS-DIAL軟件中大鼠羊水QC樣品的典型脂質總離子流（TIC）

431種脂質分子以陽離子模式被包被，主要涉及以下類別：心磷脂（CAR）；膽固醇酯（CE）；神經酰胺（CER）；二酰基甘油（DG）；溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）；溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE），磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）；磷脂酰肌醇（PI）；磷脂酰絲氨酸（PS）；磷脂酰絲氨酸（PS）；鞘磷脂（SM）和甘油三酸酯脂質，例如甘油三酸酯（TG）。

負離子模式覆蓋了270種脂質，主要涉及以下類別：脂肪酸（FA）、溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE）、磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和鞘磷脂（SM）脂質。

2.5.2 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法驗證

本實驗使用3種方法來監控實驗操作誤差并研究儀器的穩定性：①進入實驗樣品之前使用先進的10針QC樣品平衡系統；②監測所有樣品中內標物的峰高，以計算相對標準偏差（RSD）；③每10個實驗樣品后注入空白溶劑樣品和QC樣品。

為了評估系統穩定性和可重復性，使用了不同的歸一化方法來計算羊水的QC樣品的RSD值。在正模式下，PQN歸一化后的RSD值最小，為10.04%，但與沒有任何歸一化方法的結果相似。在負模式下，線性歸一化后的RSD值最小，為7.011%。歸一化后，QC樣品在正電離和負電離中都聚集在一起。這表明LC-MS系統的穩定性在整個分析過程中都很好。

2.5.3 非靶向脂質組學代謝分析

在羊水脂質組學研究中，以正離子和負離子模式比較了CK組和DH組之間的羊水脂質代謝產物。通過無偏PCA（圖3A，3B）和OPLS-DA（圖4A，4B）分析了正離子和負離子模式下每組的數據集。每個點代表一個樣本。本研究發現，在正離子和負離子模式下的OPLS-DA模型在1000個排列后適應性良好（在正離子模式下R2Y=0.877，在負離子模式下R2Y=0.997）和良好的預測（在正離子模式下Q2=0.649，在負離子模式下Q2=0.794）；但可能存在過擬合的風險（P＞0.05）（圖4C，4D）。初步的PCA模型和OPLS-DA模型均顯示，在正電離和負電離下，CK組和DH組中羊水的總體脂質變化具有較一致的分離。這提示CK組和DH組的羊水有代謝差異。

圖3 兩組羊水脂質分布的PCA評分圖

圖4 兩組羊水脂質譜的OPLS-DA評分圖和模型驗證

2.5.4 脂質差異代謝物分析

用U-檢驗和FDR校正法測定CK組和DH組羊水的脂質差異。選擇差異脂質的基礎是P＜0.05，FDR＜0.4和CK和CP組的峰高（FC）的倍數變化＞1.5。在正離子和負離子模式下，分別獲得了13和31種差異脂質（表3和表4）。其中，圖5A顯示了5種在正離子模式下FC＞2.0的脂質，例如PC、TG和PI。圖5B顯示了8種在負離子模式下FC＞2的脂質，即PC，LPC，PI、PE和SM等。通過分析羊水中不同脂質的相對種類和變化趨勢，本課題組發現，CK組和DH組之間存在著顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 羊水中脂質明顯改變的歸一化峰強度圖

表3 羊水中差異代謝物（正離子模式）

表4 羊水中差異代謝物（負離子模式）

根據前25種差異脂質的峰高繪制熱圖（圖6）。圖中的每個正方形代表每組樣品的相應強度，紅色或藍色分別代表濃度的增加或降低。顏色越深，代謝物濃度的增加/降低越強。差異脂質分別以正離子和負離子模式聚集。正離子模式下的差異脂質聚類，結果熱圖如圖6A所示。從圖中可以看出，CK組與DH組明顯不同，被分為兩個束。DH組羊水的代謝產物（LPC、TG、DG等）的水平顯著高于對照組；而PC、CE、PI以及個別TG顯著下調。負離子模式下的差異脂質聚類，結果熱圖如圖6B所示。與正離子模式類似，以負離子模式分析的脂質進一步證明對照組和DH組之間存在顯著差異，熱圖也分為兩束。與CK組相比，DH組的多數PE呈下降趨勢，而PC呈上升趨勢。結果 提示，大黃給藥后大鼠羊水中的脂質（如PI、PC、LPC、TG和PE等）可能代謝異常。

圖6 羊水中鑒定出的前25種差異性脂質的熱圖

3 討論與結論

本實驗發現，大黃給藥組活胎數明顯減少，出現吸收胎、早死胎等不正常現象，表明妊娠期應用大黃，會造成孕鼠的的胚胎發育異常。與閆麗偉等[11]研究結果一致。本實驗進一步采用LC-MS技術檢測了羊水脂質組，共鑒定出701種脂質成分，正、負離子模式下分別有431、270種。差異分析顯示，羊水脂質中主要有PI、PC、PE等磷脂及甘油三酯TG表現出代謝紊亂；大黃給藥后胚胎發育的異常可能與這些脂質的代謝異常相關。

3.1 磷脂酰肌醇（PI）

PI是膜磷脂的重要組成，參與細胞膜的形成，脂質合成和細胞生長，在維持細胞形態和促進細胞分化中起到至關重要的作用[12]。細胞內肌醇衍生物主要分為磷脂酰肌醇（PI）、4-磷酸磷脂酰肌醇（PIP）和4,5-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）[13]，參與不同的生物代謝途徑，行使其功能。發育中的中樞神經系統、骨骼肌和心肌中的高肌醇濃度強調了胚胎對這種營養素的高需求[14]。有研究發現PI(4,5)P2即4,5-二磷酸磷脂酰肌醇是神經系統發育的重要調節因子[15-17]。PI(4,5)P2通過產生脂質第二信使如二酰基甘油（DG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）[18]以及3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇，進一步調節細胞功能，參與肌動蛋白細胞骨架重組、膜運輸、細胞黏附、離子轉運蛋白及通道的活性和凋亡等過程，參與細胞生長、存活和凋亡[19]，從而調節神經系統的發育。PI(4,5)P2局部濃度的高低，對不同的細胞通路及細胞功能至關重要[20-21]。在圍孕期補充肌醇可能會降低胎兒受神經管缺陷（NTD）影響的復發風險，胚胎攝取肌醇對胚胎發育至關重要[22]。本研究發現，大黃干預后，羊水中PI濃度下降，可能大黃抑制了PI的合成和分泌，這可能是其引起胚胎吸收和早期死亡的重要原因。

3.2 磷脂酰膽堿（PC）

PC也是真核細胞膜磷脂的重要組成。PC是神經突起生長和神經元再生的重要分子[23]，如果在體內的生物合成受影響，在胚胎后發育中表現出嚴重的生長缺陷[24]。PC分子具有多樣性和復雜性，其中最豐富的磷脂種類是PC（16:0/16:0），也稱為二棕櫚酰卵磷脂（DPPC）。DPPC與多種疾病有關。DPPC可能通過摻入質膜并影響細胞膜的流動性來抑制由氣道上皮細胞和細胞因子的產生[25]。有研究表明[26]，循環PC水平與心血管事件呈正相關；含飽和脂肪酰鏈和單不飽和脂肪酰鏈的PC與心因死亡率高度正相關；而含有高度不飽和脂肪酰的PC具有心血管保護作用[27]。本實驗中本課題組發現大黃干預后，羊水中循環PC包括含單不飽和脂肪酰鏈的PC如PC 32:1，PC 36:1等含量顯著高于正常對照組；但高度不飽和的PC如PC 40:9含量反而下降。實驗結果提示，大黃可能通過改變循環PC以及高度不飽和PC的水平，影響胚胎心血管系統的發育。

3.3 磷脂酰乙醇胺（PE）

PE是磷脂的一種，又稱腦磷脂，可以改善記憶力并對肝硬化，或動脈粥樣硬化等疾病有調控作用，主要組成成分為脂肪酸和乙醇胺[28]。有研究表明，腦磷脂合成主要器官是大腦，提示其在腦組織中含量豐富，其是腦細胞膜的重要組成部分，許多基本生命過程均與腦細胞膜有關[29]。在保健品中添加腦磷脂，可以改良大腦，智力也會得到一定程度的提升[30]。也有研究發現，腦磷脂的缺失可能會導致運動神經元疾病[31]。本實驗中，大黃組磷脂酰乙醇胺PE下降，提示大黃可能通過改變PE水平，影響胚胎腦組織發育。

3.4 甘油三脂（TG）

TG體內儲量最大，是產能最多的能源物質，也是胎兒生長的重要因素。懷孕早期，胎兒無法合成脂質。胎兒的脂肪生成始于妊娠足月的肝臟和脂肪組織[32]。有研究認為妊娠期母親TG升高似乎會增加先兆子癇和早產的風險[33]。另有研究發現小于胎齡（SGA）新生兒的TG升高[34]，可能是由低密度脂蛋白（LPL）活性受損和隨后的胎兒脂肪團發育造成的。羊水中關于TG的研究很少，Rodie等[35]研究了懷有hemoglobin Bart’s diseases胎兒孕婦的羊水脂質組時發現，代謝物TG較對照組有明顯變化，而且不飽和程度高的TG主要呈下調趨勢而飽和程度高的TG主要呈上調趨勢。本實驗研究結果也類似，與對照組相比，大黃干預后孕大鼠羊水中大量的TG也發生代謝異常，主要表現為含高不飽和脂肪酸（5個以上雙鍵）的TG主要呈下調趨勢，而含有飽和脂肪酸或低不飽合脂肪酸（4個以下雙鍵）的TG主要呈上調趨勢（見表3）。大黃引起羊水中TG代謝的紊亂，但不同TG之間的差別以及對胚胎發育的影響等，有待進一步研究。

3.5 其他

以往有研究表明，許多細胞毒性和DNA損傷劑會導致鞘磷脂（SM）水平發生顯著變化[36]。本研究中，羊水中兩種氧化型的長鏈SM在大黃干預后顯著上調。SM是細胞膜的結構成分，其代謝產物調節生理和病理過程的多種細胞功能[37]，包括在細胞生長、細胞周期、細胞死亡、細胞衰老、炎癥、免疫反應、代謝、對應激刺激和自噬的反應等。SM也是神經發育和神經變性的驅動因素[38]，SM在組織內堆積，嚴重者影響中樞神經系統，甚至危及生命[39]。SM在皮膚的屏障功能中也具有重要的作用[40]。本實驗結果提示大黃可能通過干擾SM的代謝，對胚胎神經系統的發育及皮膚屏障功能產生不利的影響。

此外，本實驗中發現大黃組羊水中溶血磷脂酰膽堿LPC 20:3/0:0顯著升高。有研究發現LPC 20:3/0:0與雄性后代的頭圍有關，可能影響大腦的發育[41]。

3.6 結論

綜上所述，本研究建立了一種利用UHPLC-QExactive Orbitrap MS高分辨率質譜分析羊水脂質組學的方法。利用MS-DIAL軟件和LipidBlast數據庫，本課題組分別鑒定了431種正離子模式和270種負離子模式的脂質。其主要成分為磷脂、鞘磷脂、脂肪酸及甘油三酯等。通過對脂質的鑒定和分析，發現大黃干預后可能導致孕鼠羊水脂質（如PI、PC等）代謝紊亂。鑒于脂質在胚胎發育中具有重要作用，推測脂質代謝的紊亂可能影響大鼠胚胎的正常發育。但是本課題組的研究還有較大的局限性：本實驗屬于非靶標脂質組學實驗，鑒定的脂質進行了相對定量而非絕對量化；此外，上述推論尚缺乏藥理毒理實驗研究的證實，將來需進一步分析生物樣本中的發育毒性相關脂質，探討在細胞功能和病理生理中的作用。