基于慢病毒介導的NLRP3過表達對艾灸調控實驗性RA家兔關節滑膜液anti-CCP、RF水平的影響*

楊馨，王燚，楊慎峭，馬文彬，吳菲，席東來，路曉清，陳俊，周海燕**

（1.成都中醫藥大學養生康復學院 成都 610075；2.成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610075；3.成都中醫藥大學外語學院 成都 610075）

類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以關節滑膜持續慢性炎癥、進行性軟骨和骨破壞、自身抗體產生為特征的自身免疫性疾病[1]，炎癥就是劇烈免疫反應的結果。現代研究證實，機體的固有免疫和適應性免疫均在RA發病中起著重要作用[2]。RA是一種嚴重的慢性疾病，發病率在0.4%-1.3%之間[3]。在RA中，持續性滑膜炎癥的存在最終導致肌腱、關節囊、軟骨和骨出現進行性和不可逆性破壞以及功能障礙[4]。艾灸作為一種無明顯毒副作用的中醫外治療法，被廣泛用于RA的治療并取得較好的臨床效果[5-8]。NOD樣受體相關蛋白3（NOD-like receptor associated protein 3，NLRP3）炎癥小體是先天性免疫的主要組成，而抗環瓜氨酸多肽抗體（anti-cyclic citrulline peptide，anti-CCP)和類風濕因子（Rheumatoid factor，RF）的產生是RA自身免疫失常的特征之一[9]；NLRP3作為炎性細胞因子的觸發器，與其下游的白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）的活化與釋放相關，而IL-18對RA的發生發展具有全局性的影響。我們的前期研究已經證實艾灸能夠抑制NLRP3 mRNA的表達和炎性細胞因子的釋放，從而減輕滑膜的炎癥。因此，鑒于NLRP3炎癥小體在“炎癥-免疫”反應中的紐帶作用，在人體先天性免疫中的關鍵調節作用，本實驗通過慢病毒載體來介導NLRP3在實驗性RA家兔體內的過表達，居于艾灸的抗炎效應，觀察其對膝關節滑膜液免疫效應因子anti-CCP、RF，炎性細胞因子IL-18含量的影響，討論NLRP3在艾灸調整RA免疫，實現其抗炎效應中的作用，探索艾灸對實驗性RA異常免疫功能的影響，進一步探討其NLRP3調控機制。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗動物

1.1.1 動物

日本大耳白兔30只，2.0 kg≤體質量≤3 kg，雌雄各半，成都中醫藥大學實驗動物研究中心（許可證編號：SYXK（川）2019-049）提供。動物于實驗前進行適應性馴養，時長為1周。普通動物飼養條件。

1.1.2 分組

原則：按體質量、性別分層，30只家兔隨機分為空白對照組（簡稱空白組）、RA模型組（簡稱模型組）、艾灸治療組（簡稱艾灸組）、艾灸+NLRP3過表達組（簡稱NLRP3過表達組）、艾灸＋NLRP3陰性對照組（簡稱NLRP3陰性對照組），6只/組。

1.1.3 動物處置

遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》（國科發財字〔2006〕398號）；成都中醫藥大學實驗動物研究中心批準，倫理審核申請備案編號為2018-22。

1.2 主要試劑藥品及儀器

1.2.1 試劑

①福氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，FCA），美國Sigma公司，批號：F5881；②NLRP3過表達慢病毒載體LV-NLRP3（22143-1）：2E+8TU·mL-1，上海吉凱基因公司，批號：GCD0220715；③Rabbit CCPAb ELISA KIT/ Rabbit RF ELISA KIT/Rabbit IL-18 ELISA KIT，上海茁彩生物科技有限公司，批號：ZC-54615/ZC-54611/ZC-52384。

1.2.2 藥品

小艾柱（4×10 mm），濟南歐脈醫療器械有限公司，批號：09000314471。

1.2.3 儀器

①SpectraMAX Plus384酶標儀，美谷分子儀器有限公司；②UPH-Ⅱ-10T優普超純水制造系統，成都超純科技有限公司；③移液槍，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；④槍頭，美國Axygen公司；⑤EP管，美國Axygen公司；⑥軟皮尺，精度：1MM。

1.3 造模方法

1.3.1 RA模型塑造

模型組、艾灸組、NLRP3過表達組、NLRP3陰性對照組各家兔雙后腿膝關節剃毛、消毒后，將FCA平均注入兔雙膝關節腔內（0.5 mL·kg-1，穿刺點：髕骨下緣、臏韌帶外側凹陷），空白組同法注入等量無菌生理鹽水作對照。該模型為實驗性RA的經典模型[10]，課題組在既往研究中反復多次塑造獲得成功，并觀察到實驗性RA動物模型在造模后滑膜組織發生明顯的炎性反應。

1.3.2 慢病毒介導NLRP3炎癥小體過表達模型塑造

在體操作之前，先進行感染效率驗證（體外分離、培養兔滑膜細胞并轉導NLRP3過表達慢病毒載體Lv-NLRP3-GFP，Western blot和RT-PCR檢測NLRP3蛋白及mRNA表達情況-由上海吉凱基因化學技術有限公司完成）。根據文獻[11]，造模后第3天和開始治療后第10天共進行兩次NLRP3過表達慢病毒載體在體操作，應用微量注射器將NLRP3過表達慢病毒載體溶液0.34 mL（Lv-NLRP3-GFP（滴度5.0×1011TU·mL-1）10 μL+生理鹽水）平均注入NLRP3過表達組兔雙后膝關節腔內，在關節處用手輕揉5 min，幫助注入慢病毒的擴散。LvGFP同法等量注入NLRP3陰性對照組作對照，無菌生理鹽水同法等量注入空白組、模型組、艾灸組作對照。

1.4 治療方法

造模后第7天，用兔架固定艾灸組、NLRP3過表達組、NLRP3陰性對照組家兔，小艾柱灸雙側“腎俞”、“足三里”（定位：《實驗針灸學》[12]=）穴各五壯/1次/日（治療穴位部位剃毛2 cm×2 cm），6天為1個療程，總共3療程，每療程之間停1天?？瞻捉M和模型組動物同法固定作參照。

1.5 指標及檢測方法

1.5.1 膝關節周長測定

測定各組家兔后腿左、右膝關節周長（時間節點：造模前，治療后第6、12、18、21天）。

1.5.2 滑膜液抽取

實驗結束后，耳緣靜脈空氣注射處死實驗動物，同法取雙側滑膜液：膝關節腔注入1 mL生理鹽水（輕微活動膝關節混勻滑膜液）并回抽0.4 mL注入Eppendorf管，-80℃保存備用。

1.5.3 anti-CCP、RF、IL-18檢測操作

將CCP-Ab、RF、IL-18抗體包被于微孔板中，制成固相載體后，進行加樣、配液、洗滌、顯色、終止，最后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.6 統計學處理

統計分析采用SPSS 19.0軟件。數據以均數±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，方差齊，選用LSD檢驗；方差不齊，選用Tamhane’s T2檢驗。統計學意義標準：P＜0.05為有差異。

2 結果

2.1 艾灸對實驗性RA家兔膝關節周長的影響

結果參照表1、表2及圖1、圖2。根據結果可以看出，各組家兔左、右后膝關節周長在造模前無明顯差異（P＞0.05），提示各組實驗動物可以進行比較；模型組較空白組家兔左、右后膝關節周長在治療后第6、12、18、21天均顯著增長（P＜0.01），炎癥反應持續存在，提示實驗性RA模型塑造成功；艾灸組較模型組在治療后第6、12、18、21天測得左、右后膝關節周長明顯下降（P＜0.01）；NLRP3過表達組較艾灸組在治療后第6、12、18、21天測得左、右后膝關節周長明顯增長（P＜0.05），NLRP3過表達陰性組較艾灸組在治療后各個時間點左、右膝關節周長無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功，在NLRP3炎癥小體過表達的情況下，艾灸治療RA的抗炎消腫作用有明顯抑制。

圖1 各組家兔在造模前及治療后各個時間段左膝關節周長變化圖

圖2 各組家兔在造模前及治療后各個時間段右膝關節周長變化圖

表1 各組家兔左后膝關節周長比較（±s，n=6）

表1 各組家兔左后膝關節周長比較（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組造模前（cm）9.870±0.216 9.830±0.206 9.913±0.146 10.000±0.245 9.900±0.200治療后第6天（cm）9.960±0.232 10.960±0.288·10.300±0.107◆10.811±0.136▼10.330±0.164治療后第12天（cm）10.010±0.166 10.970±0.258·10.263±0.200◆10.767±0.16▼10.050±0.127治療后第18天（cm）10.020±0.199 11.100±0.249·10.100±0.131◆10.544±0.230▼10.060±0.212治療后第21天（cm）9.990±0.145 10.910±0.160·10.025±0.175◆10.333±0.166▼10.040±0.217

表2 各組家兔右后膝關節周長比較（±s，n=6）

表2 各組家兔右后膝關節周長比較（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組造模前（cm）9.990±0.173 9.930±0.183 9.925±0.191 9.989±0.242 9.860±0.178治療后第6天（cm）9.920±0.193 11.050±0.259·10.263±0.160◆10.800±0.166▼10.320±0.175治療后第12天（cm）9.990±0.223 11.070±0.245·10.250±0.160◆10.767±0.1942▼10.050±0.143治療后第18天（cm）10.030±0.164 11.370±0.221·10.163±0.119◆10.511±0.169▼10.100±0.194治療后第21天（cm）10.070±0.125 11.210±0.179·10.013±0.113◆10.311±0.190▼10.010±0.202

2.2 艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP含量的影響

結果見表3及圖3。根據結果可以看出，模型組較空白組anti-CCP含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組anti-CCP含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組anti-CCP明顯升高（P＜0.05）；提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節滑膜液中anti-CCP的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組anti-CCP含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響

表3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響（±s，n=6）

表3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3陰性對照組anti-CCP（ng·mL-1）8.898±3.000 14.370±2.837·9.897±2.223◆13.793±3.170▼9.395±1.786

2.3 艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響

結果見表4及圖4。根據結果可以看出，模型組較空白組RF含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組RF含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組RF含量明顯升高（P＜0.01），提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節滑膜液中RF的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組RF含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF水平的影響

表4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響（±s，n=6）

表4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組RF（ng·mL-1）0.322±0.122 0.587±0.108·0.320±0.115◆0.662±0.152▼0.495±0.091

2.4 艾灸對實驗性RA家兔IL-18含量的影響

結果見表5及圖5。根據結果可以看出，模型組較空白組IL-18含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組IL-18含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組IL-18含量明顯升高（P＜0.01），提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節滑膜液中IL-18的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組IL-18含量無顯著差異（P＞0.05），與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組IL-18含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響

表5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響（±s，n=6）

表5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組IL-18（ng·mL-1）10.278±0.899 13.360±1.246·10.087±0.683◆12.428±1.440▼9.877±0.502

3 討論

免疫反應與炎癥在組織、細胞、分子信號水平關系密切，適度的免疫反應對機體有利，但過度的免疫反應卻會對機體產生傷害，導致機體內環境的穩態被破壞而致病[13]，免疫功能失調就是RA發病的主要原因。NLRP3炎癥小體是機體先天性免疫系統的關鍵調節者，是調控炎性細胞因子產生的最主要途徑[14-15]，近來研究發現，先天性免疫失調會促使大量炎性細胞因子的釋放[16]，而炎性細胞因子的分泌在NLRP3相關通路傳導受抑制的情況下可有效減少，RA的發展進程得到控制[17-18]。NLRP3作為炎癥小體的主要組成部分，能識別體內多種危險信號，通過結合ASC，形成具有促炎活性的Caspase-1，進而誘導IL-18的生成引起炎癥反應，在機體免疫炎癥中發揮關鍵作用[19]。IL-18是NLRP3炎性小體的下游效應分子，在RA的發病過程中十分關鍵，對RA的發生具有全局性影響，能誘導其它炎癥因子、黏附分子及炎癥介質的分泌與合成[20-21]。

研究表明NLRP3與RF等自身抗體具有顯著相關性[22]。anti-CCP、RF等免疫分子的異常增多與RA的發生發展密切相關[23]。基于anti-CCP在RA中的高度特異性[24-25]，RF在RA中的高度敏感性，2010年ACR和歐洲抗風濕聯盟（European League Against Rheumatism，EULAR）制定的新RA分類標準增加了anti-CCP指標[26]。以往anti-CCP、RF等聯測模式多用于提高診斷[27-30]的準確性，實際上，anti-CCP、RF的量化能夠敏感地反映RA免疫反應的程度：RF含量與自身免疫反應劇烈程度呈現正相關，隨病情發展增加[31]，與病情處于活動期、病程長有關，劇烈的免疫反應會加快炎癥的進程。當病情得到控制后，RF滴度降低，其含量變化對判斷RA預后具有重要意義。另外，滑膜液中的RF還會與變性IgG結合，形成中等大小的免疫復合物后沉積于關節滑膜，從而導致慢性、免疫炎癥性損傷；anti-CCP是RA的臨床監測指標，與RA的活動性、病情嚴重程度及病情發展有關，用于判斷RA疾病活動程度及骨侵蝕嚴重程度[32-34]。

RA發病之根本所在，是標實的同時寓有本虛，先天稟賦不足，腎精虧虛。因此，溫腎固本，通經活絡，扶正以祛邪是類風濕性關節炎的治療之根[35-36]。艾灸之法，溫經散寒、扶正祛邪、調理陰陽，因此常用于各種經脈痹阻、陽氣不足所致之癥。本實驗選穴足三里、腎俞，分別為胃經下合穴與腎之背俞穴，具有調理脾胃、調理先天之本、振奮正氣之效。二者配伍，后天補先天，先天生后天，使陽氣內生，匡扶正氣。臨床研究、系統性評價業已證實艾灸具有較好的臨床治療效果[5-8]及循證醫學證據[37]支持。我們的前期研究表明艾灸對實驗性RA具有明確的抗炎效應和免疫調整作用，且能夠良性調整引發持續性滑膜炎癥的炎性細胞因子的分泌及其信號傳導通路[38-45]。結合本次實驗結果，提示艾灸可降低家兔雙側膝關節腫脹程度及滑膜液中免疫效應因子anti-CCP、RF，促炎性細胞因子IL-18的含量，在NLRP3過表達的情況下其作用顯著降低，說明艾灸可能通過有效調控實驗性RA家兔關節滑膜液中anti-CCP、RF、IL-18的含量來實現抑制實驗性RA家兔異常免疫反應，從而實現其抗炎調節作用，而這一作用的實現可能與NLRP3表達情況有密切關聯。本實驗結果也印證了“炎癥就是劇烈免疫反應的結果”。近年來，隨著醫學的發展和進步，已基本明確了NLRP3的結構，但是NLRP3是如何啟動、激活、調控的，尤其在RA中，尚處于探索研究階段。RA是一個以自身免疫抗體產生為特征的自身免疫性疾病，作為免疫與炎癥的紐帶，以NLRP3為切入點，艾灸-NLRP3-anti-CCP/RF-IL-18為研究主線，有望在艾灸治療RA的研究領域取得新進展，可以為臨床探索RA的治療提供新思路，為艾灸治療RA提供實驗依據。