中西藥治療糖尿病視網膜病變db/db小鼠的研究進展*

何潤西，黎曉冬，張梅，謝學軍

（1.成都中醫藥大學眼科學院 成都 610075；2.成都中醫藥大學藥學院 成都 611137；3.成都中醫藥大學附屬醫院 成都 610072）

糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是一種與糖尿病相關的致盲性眼病。由于患者視力進行性下降甚至喪失，可能加重經濟負擔，同時影響心理健康，因此，是目前亟待解決的公共衛生問題。國際糖尿病聯盟發布的最新數據顯示，2019年全球約4.6億成人患有糖尿病，其發病率在全球范圍呈上升趨勢[1]。而我國成人DM患者約達1.2億，位居全球第一，其中2型糖尿病并發DR的患者比例高達30.1%[2]。DR被定義為高度組織特異性的神經血管并發癥、神經病變和膠質細胞活化是DR的主要發病機制[3-4]。目前，DR的西醫治療包括激光治療、玻璃體內注射抗血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等局部或全身治療，療效顯著，但存在諸多并發癥[5-6]。DR屬于中醫學的“消渴目病”范疇，基本病機為本虛標實，早期是陰虛燥熱，隨著病情發展，逐漸氣陰兩虛，最后陰陽兩虛，氣滯、痰濕、血瘀作為致病因素及病理產物在本病的發生發展中起重要作用[7]。已有大量研究證實了單味中藥提取物、中成藥以及中藥復方在防治DR發生發展的確切療效[8-10]，但具體作用機制仍需要進一步研究。

目前研究糖尿病及其并發癥的動物模型主要包括實驗性、自發性、轉基因糖尿病動物模型3類。其中，自發性疾病動物模型是在自然情況下發生的疾病，未經人工處置或通過遺傳育種培養而保留，病理生理與人類某種疾病有相似之處，因此，常用于研究糖尿病的病因和發病機制，是公認的糖尿病模型。其中，ob/ob、db/db和Obese Zucker是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）糖尿病藥物研發指南所述的2型糖尿病常用動物模型，國外開發口服降糖藥及并發癥的新藥多選用此類動物。ob/ob小鼠為瘦素基因突變，4周時可發生輕度肥胖，表現出高胰島素血癥和糖耐量受損，但直至15周才發生嚴重的肥胖和糖尿病。由于ob/ob小鼠不具有血液高凝狀態，與人類2型糖尿病不同，因此，不能用于糖尿病腦血管和心血管并發癥方面的研究。1966年美國Jackson實驗室在C57BL/Ks小鼠中發現了糖尿病突變基因（db），是位于小鼠4號染色體的瘦素受體基因發生突變所致，主要表現為下丘腦缺陷，對飽感物質（瘦素）缺乏反應。db/db小鼠就是利用此突變基因成功造出的自發性的糖尿病動物模型，命名為db/db小鼠動物模型[11]。由于db/db小鼠遺傳背景明確、模型穩定，其癥候特點是肥胖、持續性高血糖、胰島素抵抗和血脂異常，也可表現出如糖尿病腎病、糖尿病周圍神經病變與DR等糖尿病并發癥，與人類2型糖尿病極為相似[12]。因此，db/db小鼠是研究DR的理想動物模型。

本文整理了以db/db小鼠為模型開展的DR中西藥治療相關研究，并總結db/db小鼠DR的癥狀表現以及藥物干預研究，以期為今后DR的防治提供思路。

1 db/db小鼠的癥狀和病理表現

1.1 全身表現

T2DM屬中醫學肥胖、消渴等范疇，病位在五臟，以胃、脾、腎為主，實則陽明、虛則太陰是T2DM的基本病機[13]。早期以多食、多飲、多尿為主要臨床特征，隨著疾病進展，血糖升高、尿微量白蛋白排泄（UAE）增加，身體逐漸消瘦[14]。db/db小鼠在10-14天出現高胰島素血癥，4周左右貪食、肥胖，4-8周時因β細胞障礙，開始出現高血糖。在3-4個月達到血糖高峰期，并始終維持著較高的血糖和體質量水平。血清胰島素、總膽固醇和甘油三酯水平均明顯高于對照組正常小鼠[15]。與普通小鼠相比，db/db小鼠透射電鏡下腎小球基底膜增厚，足細胞數量減少，足突增寬、融合[16]。足底熱敏反應時間顯著增加，血清中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及背根神經節中Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-κB（NF-κB）p65等的表達水平也顯著增強[17]。

1.2 眼部表現

db/db小鼠角膜染色后呈點狀著色、上皮細胞形態異常、神經密度降低及知覺減退，與糖尿病角膜病變特征相吻合[18]。db/db小鼠模型很好地復制了DR的血管改變及神經退行性等特征，包括視網膜內皮細胞/周細胞功能異常、神經節細胞（RGC）凋亡及膠質細胞增生[19]。

對DR視網膜組織形態學異常時間順序的研究發現，與正常小鼠相比，db/db小鼠的RGC數量從12周開始明顯減少，視網膜厚度增加，視網膜各層松散無序[20]。18周時內叢狀層腫脹、毛細血管充血擴張、走向極不規則、內皮細胞增生、微血管壁增厚、周細胞明顯減少[21]。34周時在神經節細胞層（GCL）和內核層（INL）中出現視網膜層級的排列紊亂，Müller細胞變形及數量明顯減少[22]；熒光素眼底血管造影顯示：28周齡db/db小鼠視網膜有血管反光增強（熒光素管壁著染）、靜脈串珠樣等血管病變表現[23]；34周時，db/db小鼠視網膜血管通透性增加，有熒光素滲漏現象，在一定程度上反映了DR的微血管病變特點[22]；光學相干斷層掃描發現：28周齡db/db小鼠的視網膜總厚度顯著降低，尤其是顳側象限顯著變薄[24]。而34周齡db/db小鼠其GCL和INL厚度顯著降低[22]，這與視網膜組織形態學的觀察相吻合；視網膜電圖檢查發現，db/db小鼠在第5周時b波振幅值開始降低，在第8周振蕩電位Ops總波振幅顯著降低[25]。而b波及Ops總波振幅的降低是診斷早期DR的敏感指標。表明db/db小鼠可出現早期DR的神經病理改變[26]；對db/db小鼠的視覺誘發電位檢查發現，22周時N1-P1峰幅差異比正常小鼠降低了3倍，28周時N1、P1和P2波振幅較正常小鼠也顯著降低[23,27]。表明db/db小鼠的RGC對光刺激的反應敏感性降低，這也是DR早期神經病變的表現之一。

1.3 中醫證候

研究發現，陽明熱盛證是8-14周齡db/db小鼠的主要證候，兼有痰濕、氣虛證表現。db/db小鼠早期脾胃功能旺盛，概氣盛有余，故而善納能化、進食量不斷增加、體質量逐漸上升。脾氣虧虛、痰濕蘊阻證是14-16周齡db/db小鼠的主要證候。長期多食、飽食可損傷脾胃功能，而胃主受納，脾主運化和升清。脾失健運，胃失和降，故而納食減少。氣陰兩虛、脾腎虧虛證是16-20周齡db/db小鼠的關鍵證候，兼有腎陽虛、痰濕證。脾腎虧虛是DN的基本病機，一方面導致清濁不分，藏納失常，精微下注為濁，表現為UAE、ACR、Scr逐漸增加；另一方面，脾氣虧虛，納少日久，生化乏源，肌肉失養，陰虛之本顯現，故而身體逐漸消瘦[14]。

2 藥物干預研究

DR是高糖條件下多種病理因素綜合導致的致盲性眼病，其發病機制復雜且相互關聯。通過不同的西藥、中藥單體提取物及中藥復方干預db/db小鼠的實驗研究發現，不同的藥物防治DR具有相同或不同的藥理分子機制與治療靶點，同一藥物也可能靶向于不同的信號通路，調控多種分子。其給藥途徑多種多樣，可分為滴眼液形式經鞏膜途徑（局部給藥）、靜脈注射、口飼、灌胃（全身給藥）等。西藥和中藥干預db/db小鼠的藥理機制及主要治療靶點見表1。

表1 利用db/db小鼠模型研究治療DR的中藥與西藥相關藥理機制及靶點

2.1 西藥治療

2.1.1 生長抑素

神經病變是DR的重要發病機制，因此，有效預防和治療DR神經病變，對于延緩DR的進展具有重要意義。生長抑素是視網膜色素上皮合成最重要的神經保護劑之一，對于DR狀態下小膠質細胞介導的炎性反應具有保護作用，且對DR早期電生理改變具有改善作用[28]。研究發現，在db/db小鼠模型中局部施用生長抑素，干預2周后，生長抑素可通過抗炎作用，預防DR視網膜神經功能障礙和神經變性[29]。而生長抑素神經元的缺失，可導致下丘腦炎癥的加重，從而使小鼠再現DR表型[30]。

2.1.2 胞磷膽堿

胞磷膽堿是一種內源性化合物，在細胞膜磷脂的生物合成途徑中起重要作用，特別是磷脂酰膽堿水平，能夠增加中樞神經系統中神經遞質的水平。研究發現，胞磷膽堿局部給藥可通過激活神經膠質、減少細胞凋亡、增加突觸素、下調NF-κB和TNF-α來預防糖尿病小鼠的視網膜神經變性[31]。

2.1.3 波生坦

實驗表明，內皮素（ET）-1是一種有效的血管收縮肽，在糖尿病微血管異常和神經病變的發病機制中起著重要作用[3,32]。內皮素受體阻斷可防止糖尿病和半乳糖喂養大鼠視網膜中細胞外基質成分mRNA表達增加和毛細血管基底膜增厚，而內皮素雙受體拮抗劑可影響鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜中VEGF水平的變化[33-34]。波生坦是一種雙重內皮素受體拮抗劑，Bogdanov等[35]將波生坦作用于10周齡db/db小鼠，每天給藥2次，連續給藥14天，發現db/db小鼠視網膜中ET-1及其受體A（ETA）和B（ETB）上調，糖尿病小鼠反應性神經膠質增生顯著減少，賦形劑治療的糖尿病小鼠視網膜神經節細胞的減少和視網膜血管中TNF-α的上調被顯著抑制，提示波生坦可有效預防糖尿病視網膜神經變性。

2.1.4 胰高血糖素樣肽-1

慢性高血糖導致的氧化應激在DR等糖尿病并發癥中起著關鍵作用[36]。氧化應激不僅能促進糖尿病視網膜病變的發展，還會導致對血糖控制的抵抗[37]。研究表明，胰高血糖素樣肽1（GLP-1）在實驗性DR中發揮著有益作用。不僅可以下調VEGF、促炎細胞因子和促凋亡信號傳導、還可以減少谷氨酸介導的興奮性毒性，并通過減少神經細胞凋亡和膠質細胞活化來抑制神經損傷[37-40]。GLP-1局部治療21周齡db/db小鼠3周后，發現GLP-1可以增加糖尿病視網膜中谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和CuZnSOD和MnSOD的蛋白水平來保護免受氧化應激，從而調節糖尿病視網膜中的抗氧化防御系統，并有利于DNA的修復和保護神經元細胞的增殖[41]。

2.1.5 C1q/TNF相關蛋白-9

C1q/TNF相關蛋白-9（CTRP9）是一種脂肪細胞因子，具有抗炎、抗氧化、血管舒張和抗動脈粥樣硬化的作用，在葡萄糖代謝和血管保護中發揮著有益作用，可降低糖尿病小鼠血糖[42]。研究發現，將表達CTRP9的腺病毒載體靜脈注射到12周齡的db/db小鼠中，15天后發現CTRP9抑制白細胞介素-1β、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1和粘附分子在db/db小鼠視網膜中的表達。CTRP9還能抑制db/db小鼠視網膜中NF-κB的激活，并防止db/db小鼠視網膜中BRB的分解和緊密連接蛋白的下調，定性和定量地減輕早期糖尿病視網膜血管滲漏，保護血視網膜屏障[43]。

2.1.6 非諾貝特

非諾貝特屬于貝特類，非諾貝特酸是其活性代謝物，是過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）的激動劑[44]。PPARs可調節脂質代謝和葡萄糖穩態，為視網膜脂質代謝和神經元存活所必需[45]。將非諾貝特喂食于8周齡db/db小鼠12周，發現與常規食物喂養的db/db小鼠相比，非諾貝特喂養小鼠視網膜數量下降得到緩解，視網膜線粒體呼吸率降低，糖酵解減少，并對內皮細胞產生PPARα依賴性的保護作用[46]。

2.1.7 羥苯磺酸鈣

羥苯磺酸鈣一水合物（CaD）具有全身抗炎和抗氧化作用，常用于糖尿病視網膜病變的治療。在預防DR早期進展方面效果明顯，但其在DR中的作用機制仍有待闡明[47]。對db/db小鼠進行每天口服CaD（200 mg·kg-1）或賦形劑治療15天，免疫組織化學分析檢測視網膜中氧化應激（二氫乙錠、丙二醛）、NF-κB和促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1）水平。結果 發現，CaD顯著降低了db/db小鼠視網膜中氧化應激生物標志物，并通過抑制HRECs中IKKB-α的磷酸化來抑制IL-1β誘導的NF-κB的激活，并劑量依賴性地減少TNF-α誘導的IL-6和IL-18的上調[48]。

2.1.8 葉酸

葉酸（FA）即維生素B9，參與一碳代謝，DNA合成、DNA修復、甲基化和氨基酸代謝等多種生物過程均需要FA的參與。機體無法合成FA，因此必須從飲食中補充[49]。Lei等[50]將FA作用于db/db小鼠。結果 表明，雖然FA無法改善db/db小鼠高血糖癥狀，但FA在其DR早期對視網膜變薄起到保護作用。此外，與鹽水治療的對照組相比，FA治療的db/db小鼠視網膜血管生成（CD31和VEGFR）、炎癥（IL-1β和NLRP3）和氧化應激（3-NT、4-HNE、Vav2和NOX4）的表達水平以及對應指標的血清水平顯著下調，血清同型半胱氨酸水平也顯著降低。FA通過對血管生成、炎癥和氧化應激的潛在抑制作用，針對DR發展中多個級聯的潛在信號來改善DR的視網膜病變。

2.1.9 氟苯尼酮

DR是導致視力下降的疾病之一，約75%的糖尿病患者在發病后15年內出現視網膜病變的臨床癥狀[51]。DR由血管變化引起的缺血性和炎性疾病的惡化引起，白斑病的發展、基底膜的增厚、視網膜新血管形成和玻璃體視網膜界面處的纖維血管組織形成，是成人視力喪失的最主要原因[52]。Xiong等[53]將5周齡db/db小鼠用每日劑量的氟苯尼酮或安慰劑進行治療，持續治療18周。結果 發現，與非糖尿病對照組相比，轉錄因子Islet-1和VEGF在db/db小鼠視網膜中的表達上調，視網膜血管滲漏增加和緊密連接蛋白水平降低。氟苯尼酮治療后，Islet-1和VEGF在視網膜中的表達下調。表明氟非尼酮系統給藥可恢復db/db視網膜組織中閉鎖蛋白的表達，保護視網膜緊密連接并減少視網膜血管滲漏。

2.2 中醫治療

2.2.1 小檗堿

小檗堿是從黃連、黃柏等根莖提純出來的異喹啉類生物堿，是一種廣譜抗菌藥物，具有抗氧化、抗菌及抗炎等多重功效[54]。《傷寒論》中記載：“傷寒胸中有熱，胃中有邪氣，腹中痛，欲嘔吐者，黃連湯主之”，“熱利下重者，白頭翁湯主之”，因此其被長期應用于多種細菌引起的消化系統疾病[55]。Yin等[56]將小檗堿灌胃給藥db/db小鼠10周，發現小鼠空腹血糖、總膽固醇和甘油三酯水平降低。同時，小鼠視網膜中TNF-α和IL-1β的含量降低，VEGF、VEGF受體2、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和NF-κB p65蛋白表達下調。表明小檗堿可通過調節糖脂代謝和抑制HIF-1α/VEGF/NF-κB通路改善糖尿病視網膜病變的發展。

2.2.2 人參皂苷

人參皂苷Rg1（GRg1）是一種甾體皂苷，在人參、三七和西洋參中含量豐富，其滋陰補腎、補氣養血，具有很強的抗氧化、降血糖和抗凋亡活性。Gao等[57]將GRg1口服給藥22周齡db/db小鼠2個月，發現GRg1可降低血糖、血脂和HbA1c水平，改善糖尿病誘導的視網膜通透性，防止視網膜神經節細胞層（GCL）和內核層（INL）損傷，減少視網膜GCL和INL細胞凋亡。

2.2.3 三七皂苷

三七皂苷R1（NGR1）是從五加科植物三七的根莖中提取的有效成分，其活血祛瘀、通脈活絡，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等特性[58]，可治療糖尿病性腦病和改善微循環障礙。Zhou等[59]將5月齡db/db小鼠通過管飼法給藥12周后，發現db/db小鼠的視網膜血管變性、視網膜厚度減少和視網膜功能受損顯著減弱。而NGR1預處理的高葡萄糖（HG）的大鼠視網膜Müller細胞（rMC-1）和db/db小鼠的視網膜凋亡、VEGF表達以及氧化應激和炎癥反應顯著下調，PEDF表達顯著增加。表明NGR1可通過降低細胞凋亡預防DR的進展。

2.2.4 紅芪多糖

紅芪為豆科植物多序巖黃芪的干燥根，紅芪多糖是紅芪的主要活性成分，現代藥理學研究發現，紅芪多糖具有抗炎、免疫調節、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等作用[60-61]。VEGF在DR的發生發展過程作用重大，其機制涉及內皮細胞增殖、血管通透性增高和細胞外基質改變等諸多方面。汝亞琴等[62]對11周齡db/db小鼠給予紅芪多糖治療8周后發現，紅芪多糖可有效抑制db/db小鼠視網膜VEGF基因表達和蛋白合成，從而改善DR的發展。

2.2.5 糖寧通絡膠囊

糖寧通絡膠囊主要由科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花組成。主治生津止渴，活血通絡，清熱瀉火，用于氣陰兩虛所致的消渴病。以往研究表明，糖寧通絡膠囊可通過減少1型糖尿病小鼠視網膜中炎癥巨噬細胞釋放MIP1γ，導致內皮細胞失活，是適用于糖尿病視網膜病變治療的潛在新型抗炎藥物[63]。盧珊等[64]采用不同劑量糖寧通絡膠囊灌胃治療8周齡db/db小鼠，給藥20周后，發現其空腹血糖值顯著下降，糖耐量明顯提高，糖化血紅蛋白水平明顯降低，視網膜微血管瘤的數量顯著減少。

2.2.6 渴絡欣膠囊

渴絡欣膠囊（KLX）是國內臨床用于糖尿病腎病（微血管病變）治療的復方中藥制劑，具有益氣養陰、活血化瘀的功效[65]。羅云等[23]將低、中、高劑量渴絡欣膠囊灌胃治療db/db小鼠，連續給藥20周后，發現渴絡欣膠囊低、中劑量組能顯著改善神經節細胞層和內網狀層厚度，且顯著優于陽性藥羥苯磺酸鈣。并可改善db/db小鼠視網膜早期微血管病變和視網膜功能。

3 小結

DR是2型糖尿病中嚴重的視網膜神經血管單元并發癥，也是當前致成年人失明主要的眼底疾病。當非增殖性糖尿病視網膜病變（Non proliferative diabetic retinopathy，NPDR）進展為增殖性糖尿病性視網膜病變（Proliferative diabetic retinopathy，PDR），治療方法有限且不理想，患者多接受反復治療（如激光光凝或玻璃體腔注射抗VEGF藥物等），造成沉重的社會經濟負擔[66]。因此，新藥研發對于防治DR的發生發展非常關鍵。動物模型是藥物研發的有力工具，db/db小鼠作為瘦素受體基因db突變引起的T2DM小鼠，其在不同生長時期的臨床表現以及出現的嚴重的高血糖及腎損傷進展與人體極為相似，因此成為當前T2DM研究中應用較為廣泛的動物模型。

西藥治療db/db小鼠DR常作用于視網膜神經、血管以及小膠質細胞，通過下調視網膜ET受體、抑制視網膜神經變性和VEGF表達、阻止視網膜細胞凋亡、抗氧化、減少糖酵解以及逆轉緊密連接來延緩DR進程。中藥治療db/db小鼠DR常通過抑制氧化應激、炎癥反應、增強線粒體自噬、調節糖脂代謝、降低血管通透性、保護視網膜微血管功能、增加糖耐量、降低神經元細胞損傷、改善神經傳導、改善微循環來改善DR。中西藥治療DR方法多樣，療效顯著，既有不同治療機制，但其亦有共同的治療靶點。同時發現，隨著db/db小鼠癥候的演變，其病機在不同階段亦有所不同。然而，目前對其治療研究僅著眼于指標變化，未結合其中醫癥候進行深入探討。因此，結合其癥候，深入探討不同藥物對同一癥候，以及相同藥物對不同癥候的療效，得到更精準的結果，將是今后db/db小鼠DR治療的研究方向之一。

綜上所述，db/db小鼠作為研究DR發病機制及新藥研發的動物模型優勢明顯，但目前該模型主要用于NPDR階段的研究[67]。西醫和中醫在DR的治療中各有側重，但亦有共同治療靶點。本文在概述糖尿病動物模型db/db小鼠主要特點以及病變評估的基礎上，對其在DR的發病機制及藥理研究方面的相關中西藥治療進展進行總結，以期為中西醫結合防治早期DR提供一定的參考依據。