兒童特應(yīng)性皮炎中醫(yī)辨證分型特點(diǎn)及各證型的免疫表型研究*

翟盼盼，黃巖杰，**，梅曉峰，李佳佳，李秀敏，張霞，翟文生，任獻(xiàn)青，丁櫻，薛晨紅，錢革，苗明三

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450000；3.紐約醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)系 紐約 10595；4.河南省人民醫(yī)院 鄭州 450000；5.河南省兒童醫(yī)院 鄭州 450000）

特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種高度異質(zhì)性的慢性炎癥性皮膚病，可間斷急性發(fā)作，主要以劇烈瘙癢、反復(fù)濕疹樣皮損和皮膚干燥為主要特征，并伴有鼻炎或哮喘等過敏病史[1]。近幾十年來，隨著環(huán)境污染的加重，本病的發(fā)病率在逐年增高[2]，據(jù)報(bào)道，90%的AD患兒在5歲之前發(fā)病[3]。本課題組前期總結(jié)了AD的中醫(yī)病機(jī)主要在于肺脾陰陽失調(diào)，津液輸布失常，心火濕熱搏于肌膚，寒熱錯(cuò)雜[4]。中醫(yī)治療可調(diào)節(jié)機(jī)體的陰陽失衡狀態(tài)，遠(yuǎn)期療效滿意，安全性高，易于被家長接受。然而兒童AD的中醫(yī)證型分布是否具有獨(dú)特性？本文采用2013年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)皮膚科專業(yè)委員會(huì)制定的《特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療方案專家共識(shí)》[5]中的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步總結(jié)兒童AD的中醫(yī)證型分布特點(diǎn)。

免疫異常是AD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，兒童AD存在T細(xì)胞亞群的異常激活，T細(xì)胞過度分化為Th2細(xì)胞，產(chǎn)生白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）和白細(xì)胞介素5（Interleukin-5，IL-5）等Th2細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）合成，肥大細(xì)胞活化和外周血嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophil，Eo）增多[6]。隨著免疫學(xué)研究的逐步深入，有報(bào)道Th17細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素17（Interleukin-17，IL-17），以劑量依賴性方式降解皮膚中緊密連接的關(guān)鍵成分claudin-1和claudin-4蛋白，從而破壞AD患者的皮膚屏障[7]。目前疾病管理并沒有充分考慮上述免疫功能的紊亂在兒童AD的不同證型間是否存在差異，忽略了基于不同證型的針對(duì)性治療。為闡明這一科學(xué)問題，本研究深入探索了不同證型AD兒童Th1/Th2/Th17的免疫表型，對(duì)于揭示兒童AD不同證型的免疫表型特點(diǎn)，探尋療效評(píng)價(jià)的客觀指標(biāo)和制定個(gè)體化的靶向治療具有重要價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過對(duì)2018年4月—2020年12月就診于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院的門診及住院病例進(jìn)行篩選，最終納入159例AD患兒，年齡在6月-14歲。所有患兒西醫(yī)診斷均符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，中醫(yī)辨證分型參照《特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療方案專家共識(shí)》[5]中的證型判定標(biāo)準(zhǔn)。100例正常對(duì)照組兒童來自河南省內(nèi)自愿參加本研究的同齡兒童。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得了參與者或其監(jiān)護(hù)人（家長）的書面知情同意。收集所有受試者的性別、年齡、個(gè)人及家族過敏史以及近3月的用藥明細(xì)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。中醫(yī)辨證分型參照《特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療方案專家共識(shí)》中的證型判定標(biāo)準(zhǔn)[5]，具體如下：心脾積熱證：臉部紅斑、丘疹、脫屑或頭皮黃色痂皮，伴糜爛滲液，有時(shí)蔓延到軀干和四肢，哭鬧不安，可伴有大便干結(jié)，小便短赤。指紋呈紫色達(dá)氣關(guān)或脈數(shù)；心火脾虛證：面部、頸部、肘窩、腘窩或軀干等部位反復(fù)發(fā)作的紅斑、水腫，或丘皰疹、水皰、或有滲液，瘙癢明顯，煩躁不安，眠差，納呆，舌尖紅，脈偏數(shù)；脾虛蘊(yùn)濕證：四肢或其他部位散在的丘疹、丘皰疹、水皰，倦怠乏力，食欲不振，大便溏稀，舌質(zhì)淡，苔白膩，脈緩或指紋色淡；血虛風(fēng)燥證：皮膚干燥，肘窩、腘窩常見苔蘚樣變，軀干、四肢可見結(jié)節(jié)性癢疹，繼發(fā)抓痕，瘙癢劇烈，面色蒼白，形體偏瘦，眠差，大便偏干，舌質(zhì)偏淡，脈弦細(xì)。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]確診為AD；②年齡在6月-14歲；③患兒及家長自愿參加臨床試驗(yàn)且依從性好，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸道感染；②近1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、激素等藥物；③肝腎功能異常或患有嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病、先天性疾病、免疫性疾病者；④排除接觸性濕疹、藥物誘發(fā)的濕疹樣皮損、原發(fā)性牛皮癬等。

1.4 脫落及剔除標(biāo)準(zhǔn)

篩選合格入組的臨床病例，在研究過程中，患兒因哭鬧嚴(yán)重，無法完成抽血，或家長拒絕留取標(biāo)本，無法完成相關(guān)評(píng)估項(xiàng)目者，應(yīng)予以剔除。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

取被檢者靜脈血2 mL，用電阻抗法在Pentra MS CRP全血細(xì)胞檢測儀（法國）上檢測外周血Eo計(jì)數(shù)。血清總IgE檢測采用免疫比濁法在IMMAGE 800特定蛋白分析儀（Beckman美國）上檢測。采用多微球流式免疫熒光儀（美國BD FACSCanto II）測定血清細(xì)胞因子，包括干擾素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）、IL-4、IL-5、IL-17（瑞斯凱爾公司，貨號(hào)：190603）。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料釆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25，P75）描述，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和構(gòu)成比描述。計(jì)量資料符合正態(tài)分布并且方差齊者，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布或方差不齊者，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料率和構(gòu)成比采用χ2檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒童AD的中醫(yī)證型分布特點(diǎn)

對(duì)159例AD患兒進(jìn)行中醫(yī)證型辨證分析，心火脾虛證有61例，占比最高（38.4%），其次為血虛風(fēng)燥證（22.0%）、心脾積熱證（20.1%）、脾虛蘊(yùn)濕證（19.5%）。皮爾森卡方檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組與4個(gè)證型之間的性別構(gòu)成差異，提示AD患兒的中醫(yī)證型分布不受性別因素影響。與正常對(duì)照組兒童比較，4個(gè)證型中，心脾積熱證AD患兒發(fā)病年齡最低（均數(shù)：2.80 vs. 4.64，P＜0.05）。與心脾積熱證AD兒童比較，脾虛蘊(yùn)濕和血虛風(fēng)燥證AD兒童的發(fā)病年齡較大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同組別的基線資料比較（n，±s）

表1 不同組別的基線資料比較（n，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與心脾積熱證比較，#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組心脾積熱證AD心火脾虛證AD脾虛蘊(yùn)濕證AD血虛風(fēng)燥證AD例數(shù)（%）100 32（20.1%）61（38.4%）31（19.5%）35（22.0%）性別（男/女）53/47 20/11 33/28 18/14 21/14年齡（歲）4.64±3.15 2.80±2.79*4.03±3.46 4.33±2.63#5.29±3.07#

2.2 不同證型AD患兒的細(xì)胞因子比較

與正常對(duì)照組比較，4個(gè)證型的AD患兒血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1A）。與正常對(duì)照組0.31±0.23 pg·mL-1比較，血清中Th2型細(xì)胞因子IL-4的水平在心脾積熱組1.82±1.49 pg·mL-1、心火脾虛組1.23±1.34 pg·mL-1、脾虛蘊(yùn)濕組1.43±1.21 pg·mL-1和血虛風(fēng)燥組1.97±1.60 pg·mL-1患兒中均顯著升高（P＜0.05）（圖1B）；與正常對(duì)照組1.27±1.30 pg·mL-1比較，血清中Th2型細(xì)胞因子IL-5的水平在心脾積熱組3.29±2.16 pg·mL-1和血虛風(fēng)燥組2.57±1.59 pg·mL-1患兒中顯著升高（P＜0.05）（圖1C）；與正常對(duì)照組0.53±0.33 pg·mL-1比較，血清中Th17型細(xì)胞因子IL-17的水平在心脾積熱組3.46±3.75 pg·mL-1、心火脾虛組2.08±1.84 pg·mL-1和血虛風(fēng)燥組2.42±1.16 pg·mL-1患兒中顯著升高（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 不同組別細(xì)胞因子的比較

2.3 不同證型AD患兒的外周血Eo計(jì)數(shù)和血清總IgE水平

與正常對(duì)照組兒童比較，心火脾虛證、脾虛蘊(yùn)濕證和血虛風(fēng)燥證AD患兒外周血Eo計(jì)數(shù)均明顯升高（P＜0.05），心脾積熱證AD外周血Eo計(jì)數(shù)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組兒童比較，心火脾虛證AD患兒血清總IgE水平明顯升高（P＜0.05），脾虛蘊(yùn)濕證和血虛風(fēng)燥證AD血清總IgE水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 不同組別的外周血Eo計(jì)數(shù)和血清總IgE水平比較[n/M（P25，P75)]

3 討論

AD是慢性復(fù)發(fā)性疾病，近幾十年來，AD患病率逐漸增加，世界范圍內(nèi)兒童AD患病率可達(dá)15%-20%[9]，已成為全球社會(huì)共同面臨的健康問題。一項(xiàng)關(guān)于用中藥治療AD小鼠的系統(tǒng)回顧和薈萃分析表明，中藥能明顯改善AD小鼠的皮膚炎癥反應(yīng)和瘙癢癥狀[10]。2020年中國AD診療指南中已明確將中醫(yī)藥納入AD的治療措施中，并重視對(duì)AD的辨證論治[11]。因此，總結(jié)兒童AD的常見證型分布，厘清病機(jī)演變對(duì)兒童AD的治療尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)AD患兒以心火脾虛證型最多見，占比38.24%，說明本病的發(fā)病與心、脾兩臟關(guān)系密切。這有別于成人AD以脾虛濕盛證（39.47%）和血虛風(fēng)燥證（31.58%）多見[12]。黃楚君等[13]基于30部古代經(jīng)典著作，篩選出48條包含AD病因病機(jī)條文，結(jié)論也顯示AD的核心病機(jī)為心火及脾虛，病性屬本虛標(biāo)實(shí)，臨床以健脾清心祛邪為治則進(jìn)行論治。林銀哲等[14]調(diào)查了廣州市112例AD患兒，將其分為心火脾虛、陰陽失調(diào)、脾虛失運(yùn)、脾虛濕困、脾虛血燥、血虛風(fēng)燥、風(fēng)濕熱癥等7個(gè)證型進(jìn)行了辨證研究，也發(fā)現(xiàn)心火脾虛證為兒童AD最常見的證型（28.6%），這與我們的結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)兒童AD的中醫(yī)證型分布受年齡影響較大，在（2.80±2.79）歲以下的AD患兒中，心脾積熱證是主要證型，提示幼兒階段，部分AD患兒可因“心常有余”、胎熱濕毒和喂養(yǎng)過度致使脾胃積熱，心火內(nèi)生，摶結(jié)于膚，發(fā)為皮疹，常見于AD急性期，為實(shí)證。因此，臨床辨證論治時(shí)還需考慮年齡特點(diǎn)。心為陽中之太陽、屬熱屬火，小兒心常有余，易受內(nèi)外因之干擾，擾動(dòng)心陽，脾常不足，脾胃之體成而未全，脾胃之氣全而未壯，若家長缺乏育兒知識(shí)，喂養(yǎng)不當(dāng)，損傷脾胃，易助濕生熱。且心主血脈，其華在面，心經(jīng)火熱與脾經(jīng)濕熱同氣相求，火性燔灼上炎于頭面，郁熾于血脈，熱盛肉腐，則可發(fā)為皮疹，這與臨床上嬰幼兒期皮疹主要始發(fā)于面頰部、額部和頭皮，逐漸發(fā)展至軀干和四肢伸側(cè)的發(fā)病特點(diǎn)相符。

在兒童AD的辨證分型中引入現(xiàn)代免疫學(xué)指標(biāo)有利于中醫(yī)辨證分型的標(biāo)準(zhǔn)化，寓證于病，從病識(shí)證，融會(huì)貫通，采取微觀與宏觀相結(jié)合、中醫(yī)和西醫(yī)相融合的診斷模式，從而為兒童AD的診療提供更有效的臨床策略，為下一步開發(fā)研制出針對(duì)不同證型的藥物提供研究證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同證型的AD患兒均存在Th2免疫失衡。Th2免疫失衡是AD中最早被發(fā)現(xiàn)的免疫失衡機(jī)制，多項(xiàng)臨床研究和動(dòng)物模型已證實(shí)Th2細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-4和IL-5在AD中普遍升高[15-16]。IL-4是B細(xì)胞的生長因子，是免疫球蛋白向IgE發(fā)生類別轉(zhuǎn)化的起始因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNCB刺激的AD小鼠模型，血清中IL-4明顯升高，而IFN-γ變化不大且沒有差異[15]。IL-4受體拮抗劑度普利尤（Dupilumab）在臨床用于治療AD，療效顯著，進(jìn)一步支持了AD中Th2型免疫途徑的重要性[17]。IL-5能夠刺激Eo增殖、分化及活化，不僅使Eo的數(shù)量增加，而且能增強(qiáng)其功能。IL-5受體拮抗劑美泊利珠單抗（Mepolizumab）在中重度AD治療中的有效性和安全性目前尚在臨床研究中[18]。近年有多項(xiàng)研究報(bào)道，中藥可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能[19-20]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有效減輕AD模型小鼠的皮膚炎癥、減少肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，并可顯著降低血清IgE水平及Th2型相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5水平[21]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)由烏梅丸化裁而成的FAHF-2復(fù)方制劑既能直接抑制小鼠肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的脫顆粒，降低IL-5水平，又能增加IFN-γ和IL-10的分泌[20]。因此，在準(zhǔn)確辨證的基礎(chǔ)上，中藥具有可靠的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)免疫功能的優(yōu)勢。

盡管所有的AD亞型都有Th2激活[22]，但針對(duì)Th2免疫失衡治療的dupilumab單抗僅對(duì)約三分之一的AD患者治療有效[23]，因此，需要額外的靶向治療來解決AD不同亞型的免疫失衡問題。研究表明，與歐洲AD患者相比，中國AD患者皮損中Th17表達(dá)更高，而IFN-γ等Th1相關(guān)的細(xì)胞因子水平較低[24]。Th17細(xì)胞因子IL-17不僅可以通過抑制AD患者皮膚中絲聚蛋白的表達(dá)而加重表皮屏障的缺陷，還可擾亂編碼角質(zhì)形成細(xì)胞黏附分子的基因的調(diào)節(jié)[25]，在AD病變皮損中的表達(dá)水平顯著升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[26]。因此，升高的IL-17可能是導(dǎo)致AD皮損加重的主要病理因素。本研究發(fā)現(xiàn)心脾積熱證、心火脾虛證和血虛風(fēng)燥證AD患兒以Th2/Th17免疫失衡為主，提示這3種證型存在更嚴(yán)重的T細(xì)胞活化和分化的功能紊亂。除上述T細(xì)胞因子失衡外，本研究還觀察到心火脾虛證、脾虛蘊(yùn)濕證、血虛風(fēng)燥證均可見外周Eo計(jì)數(shù)升高，其中，心火脾虛證還同時(shí)伴有血清IgE水平升高，表明心火脾虛證AD患兒存在更嚴(yán)重的免疫失衡，這也與心火脾虛AD患兒虛實(shí)夾雜、寒熱錯(cuò)雜、陰陽失衡的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)非常契合。因此，臨床上可通過中藥泄實(shí)補(bǔ)虛、平衡陰陽的辨證施治，達(dá)到調(diào)節(jié)AD患兒免疫紊亂的作用，并可用Eo和IgE作為療效評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，在不同證型的AD兒童中，心火脾虛證型最多見，但在（2.80±2.79）歲以下，以心脾積熱證為主要證型。此外，本研究初步探索了不同證型AD患兒的免疫失衡特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同證型AD均存在Th2免疫失衡；心火脾虛、血虛風(fēng)燥和心脾積熱證同時(shí)存在Th2/Th17免疫失衡，升高的IL-17可能是導(dǎo)致這3個(gè)證型皮損加重的主要病理因素。在未來的研究中，通過探索不同證型AD的免疫機(jī)制，了解AD不同證型的免疫表型特點(diǎn)，為進(jìn)一步制定更有針對(duì)性的中西醫(yī)結(jié)合治療方案提供指導(dǎo)，也為初步探索中醫(yī)藥辨證治療AD的分子生物學(xué)機(jī)制提供思路。