大黃素對宮頸癌細胞體外轉移活性和順鉑敏感性的影響及其機制研究*

王一娜，侯友翔，祖力皮亞木

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 婦科腫瘤放療一病區，新疆 烏魯木齊 830011）

宮頸癌是全世界女性第4大常見的惡性腫瘤，對社會造成較大的經濟和醫療負擔[1]。宮頸癌的治療通常包括手術、化療和放療，但這些治療策略并不足夠[2]。各種化學藥物，如貝伐單抗、鹽酸拓撲替康和順鉑是宮頸癌化療的一線藥物，但臨床應用時常出現嚴重的副作用和耐藥性，導致患者腫瘤復發和進一步惡化[3]。因此，提高宮頸癌細胞對現有化療藥物的敏感性，對減少化療藥物的用量及其副作用的發生具有重要意義。

大黃素是一種從蓼科植物中分離出來的活性成分，具有抗菌、抗炎和抗氧化等作用。早期研究證明大黃素對許多腫瘤細胞具有抗增殖作用，如肺癌和胰腺癌等[4]。此外，大黃素對癌細胞的抗增殖作用與抑制蛋白質酪氨酸激酶相關蛋白磷酸化有關[5]。目前，有報道顯示，大黃素對宮頸癌細胞具有抑制作用，其作用機制多與抑制細胞轉移、促進凋亡有關[6]。然而，大黃素能否提高宮頸癌細胞對現有化療藥物（如順鉑）的敏感性仍不清楚。

研究發現，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinase/ protein kinase B,PI3K/Akt）信號通路影響細胞多種生物學功能，包括細胞增殖、凋亡和血管生成等[7]。臨床研究表明，乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和肝癌組織中Akt和p-Akt的陽性表達率均較正常組織高[8]。此外，有研究發現大黃素能通過調控Akt通路，抑制肝癌細胞活性[9]。然而，大黃素對宮頸癌細胞的抑制作用是否與Akt通路相關，以及Akt通路是否影響宮頸癌細胞對大黃素的敏感性尚未見報道。因此，本研究開展了大黃素在宮頸癌細胞對順鉑敏感性方面的研究，以期為宮頸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

人宮頸癌細胞株HeLa細胞（廣州泰勒生物科技有限公司），大黃素（廣州云舟生物科技有限公司），Lipofectamine 3000（上海青旗生物科技有限公司），順鉑（美國MCE公司），AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），Transwell chamber（美國安捷倫公司），RIPA細胞蛋白裂解液（上海愛必信生物科技有限公司），胎牛血清（武漢漢恒生物科技有限公司），PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt（美國Santa Cruz公司），GAPDH抗體（南京金斯瑞生物科技有限公司）。

倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司），多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司），流式細胞儀（美國BD公司），實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養

人宮頸癌細胞株HeLa細胞置于RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清）中，在37 ℃和5%二氧化碳培養箱中培養。參照文獻[10-11]將細胞分為4組：對照組（磷酸鹽緩沖液）、順鉑組（順鉑10 μmol/L）、大黃素組（大黃素50 μmol/L）、聯合組（順鉑10 μmol/L +大黃素50 μmol/L）。培養細胞至對數生長期后按上述分組方法處理細胞48 h開展后續實驗。

1.3 細胞克隆形成試驗

當細胞生長至對數生長期時，胰酶消化收集細胞，使用培養基稀釋細胞并將細胞按2 000個/孔的密度接種于6孔板，培養24 h后，按照1.2中分組處理細胞，置于BME瓊脂培養基中培養。將培養物置于5%二氧化碳培養箱中37 ℃培養14 d，使用Image-Pro Plus軟件在顯微鏡下計數細胞集落。

1.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

在室溫下將50 μL基質膠添加到上室預先包被1 h，按不同組別處理細胞后，將200 μL細胞懸液接種到上室中，并將500 μL完全培養基添加到下室，孵育24 h，將下部小室中的細胞用4%多聚甲醛固定15 min，5%結晶紫染色，棉簽除去上室中未遷移的細胞，顯微鏡下拍照記錄并計數5個隨機視野中的細胞數。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力

將各組細胞按3 000個/孔的密度接種于96孔板中，培養24、36和48 h后加入20 μL 5% MTT溶液，37 ℃培養4 h，150 μL二甲基亞砜溶解紫色甲臜晶體，通過多功能酶標儀測量490 nm處的光密度（optical density,OD）值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

按不同組別處理細胞48 h后，用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測各組HeLa細胞凋亡情況。用不含EDTA的胰酶消化HeLa細胞，然后將200 μL細胞懸液與5 μL Annexin V、1 μL PI在室溫下孵育15 min。使用BD LSR Ⅱ流式細胞儀檢測染色細胞凋亡率。

1.7 劃痕試驗檢測細胞遷移能力

將HeLa細胞按5×104個細胞/孔接種在24孔板中，直至細胞生長貼壁，然后用200 μL移液槍吸頭劃出一個粗細均勻的劃痕。磷酸鹽緩沖液洗去分離的細胞，加入新鮮無血清培養基，并按照不同組別處理細胞。24 h后使用顯微鏡在100倍下隨機選擇區域進行拍照，采用Image J軟件計算遷移面積。

1.8 Western blotting檢測PI3K/Akt信號通路蛋白的表達

采用RIPA裂解緩沖液從細胞中提取蛋白，BCA試劑盒定量，10% SDS-PAGE分離蛋白，轉移到PVDF膜。室溫下用5%脫脂牛奶在TBST中封閉細胞膜1 h，并在4 ℃條件下加入一抗過夜。TBST洗滌膜3次，加入二抗在室溫下孵育1 h，依次進行孵育、沖洗、顯影、定影，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素聯合順鉑抑制宮頸癌細胞的增殖

對照組、順鉑組、大黃素組、聯合組細胞集落形成數分別為（286.56±12.68）、（109.77±9.21）、（116.55±8.89）、（56.67±5.98）個，經方差分析，差異有統計學意義（F=22.896，P=0.002）。與對照組比較，大黃素組和順鉑組宮頸癌細胞集落形成數減少（P<0.05）；與對照組、大黃素組、順鉑組比較，聯合組的宮頸癌細胞集落形成數減少（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞集落 （結晶紫染色×200）

對照組、順鉑組、大黃素組、聯合組細胞24、36和72 h的OD值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點OD值比較，差異有統計學意義（F=396.000，P=0.000）；②各組細胞OD值比較，差異有統計學意義（F=158.500，P=0.000），聯合組OD值低于對照組、大黃素組、順鉑組（P<0.05）；③各組細胞OD值的變化趨勢比較，差異有統計學意義（F=39.100，P=0.000）。大黃素能抑制宮頸癌細胞的增殖，并能提高順鉑對宮頸癌細胞的抑制作用。見表1和圖2。

表1 各組宮頸癌細胞不同時間點OD值的變化 （±s）

表1 各組宮頸癌細胞不同時間點OD值的變化 （±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

組別對照組順鉑組大黃素組聯合組24 h 0.61±0.03 0.39±0.07 0.36±0.08 0.28±0.03①②③36 h 1.03±0.06 0.67±0.02①0.69±0.03①0.43±0.06①②③48 h 1.78±0.11 0.81±0.06①0.78±0.02①0.52±0.01①②③

圖2 各組宮頸癌細胞OD值的變化趨勢

2.2 大黃素聯合順鉑抑制宮頸癌細胞的轉移

對照組、順鉑組、大黃素組、聯合組細胞侵襲數和遷移率比較，經方差分析，差異均有統計學意義（F=32.783和19.236，P=0.001和0.003）。與對照組比較，大黃素組、順鉑組細胞侵襲數和遷移率均減少（P<0.05）；與對照組、大黃素組、順鉑組比較，聯合組細胞侵襲數和遷移率均減少（P<0.05）。大黃素能抑制宮頸癌細胞的轉移，并提高順鉑對宮頸癌細胞的抑制作用。見表2和圖3、4。

表2 各組宮頸癌細胞的轉移能力比較 （±s）

表2 各組宮頸癌細胞的轉移能力比較 （±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

細胞遷移率/%81.33±13.51 43.89±7.38①46.93±10.12①21.35±8.66①②③19.236 0.003組別對照組順鉑組大黃素組聯合組F 值P 值細胞侵襲數/（個/HP）122.87±11.82 71.23±12.82①67.21±15.33①28.36±7.25①②③32.783 0.001

圖3 各組宮頸癌細胞侵襲能力 （結晶紫染色×200）

圖4 各組宮頸癌細胞劃痕試驗 （×100）

2.3 大黃素聯合順鉑促進宮頸癌細胞凋亡

對照組、順鉑組、大黃素組、聯合組的細胞凋亡率分別為（5.31±0.51）%、（11.19±1.12）%、（12.13±1.09）%、（23.85±2.35）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=8.872，P=0.036）。與對照組比較，大黃素組和順鉑組宮頸癌細胞凋亡率升高（P<0.05）；與對照組、大黃素組、順鉑組比較，聯合組宮頸癌細胞凋亡率升高（P<0.05）。大黃素能促進宮頸癌細胞凋亡，并提高順鉑對宮頸癌細胞的促凋亡作用。見圖5。

圖5 各組宮頸癌細胞流式細胞圖

2.4 大黃素聯合順鉑抑制宮頸癌細胞PI3K/Akt信號通路激活

對照組、順鉑組、大黃素組、聯合組PI3K/Akt磷酸化水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=8.113和9.273，P=0.021和0.017）。與對照組比較，大黃素組和順鉑組PI3K/Akt信號通路被抑制，PI3K和Akt蛋白磷酸化水平均降低（P<0.05）；與對照組、大黃素組、順鉑組比較，聯合組PI3K和Akt蛋白磷酸化水平均降低（P<0.05）。大黃素能抑制宮頸癌細胞PI3K/Akt信號通路激活，大黃素聯合順鉑后對PI3K/Akt信號通路的抑制作用增強。見表3和圖6。

表3 各組細胞PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比較 （±s）

表3 各組細胞PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比較 （±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與大黃素組比較，P <0.05；③與順鉑組比較，P <0.05。

p-Akt/Akt 0.83±0.05 0.39±0.08①0.41±0.02①0.22±0.06①②③9.273 0.017組別對照組順鉑組大黃素組聯合組F 值P 值p-PI3K/PI3K 0.62±0.02 0.33±0.03①0.31±0.02①0.16±0.01①②③8.113 0.021

圖6 各組宮頸癌細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達

3 討論

目前，宮頸癌的預防和治療仍面臨巨大挑戰，宮頸癌患者預后不良的主要原因包括腫瘤細胞侵襲和轉移[12]。化學藥物通過抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，治療多種腫瘤。作為鉑類化療藥物之一，順鉑化療方案被廣泛用于晚期宮頸癌的治療，其可以通過誘導DNA損傷、細胞周期停滯和細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用[13]。然而，由于患者對化療藥物的敏感性低，甚至產生耐藥，仍有較高的發病率[14]。因此，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，并尋找可能影響宮頸癌療效的靶點對宮頸癌的診療至關重要。本研究結果表明，大黃素可以調節宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進宮頸癌細胞凋亡，并能提高宮頸癌細胞對順鉑的敏感性。

蒽醌類為具有抗腫瘤潛力的化合物。大黃素是一種蒽醌，存在于許多植物的根部和樹皮中。其是各種中草藥的活性成分，包括大黃、何首烏、蘆薈和決明子[15]。據報道，大黃素具有抗腫瘤、促進細胞凋亡和抗增殖的作用。既往研究發現，大黃素能夠破壞分裂紡錘體，在被檢細胞的超微結構中，高爾基體中存在大量分散的池泡，證明其組織紊亂。此外，大黃素還能誘導Phalloidin標記的肌動蛋白絲的降解，以及在細胞質中形成聚集物[16-17]。本研究結果表明，大黃素處理后，宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力降低，細胞凋亡率增加，并且宮頸癌細胞對順鉑更加敏感。調節PI3K/Akt信號通路對細胞的增殖、生存、死亡和代謝非常重要，該通路的失衡與癌癥的發生、發展密切相關[18]。因此，探索PI3K/Akt信號通路的靶向調節劑具有很大的潛力。大量PI3K/Akt信號通路調節劑候選藥物正在開發中，有些已被應用于治療癌癥患者。但是PI3K/Akt信號通路仍然對治療有抵抗力[19]。最新研究表明，大黃素可調節PI3K/Akt信號通路，使肝癌細胞對索拉非尼敏感性增加。另外研究發現，大黃素可通過調節PI3K/Akt信號通路，改善免疫性血小板減少癥的間質干細胞凋亡[20]。本研究結果表明，大黃素可以抑制宮頸癌細胞系PI3K/Akt信號通路的激活，從而干預宮頸癌細胞的發展。

綜上所述，大黃素可以調節宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進宮頸癌細胞凋亡，并能提高宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，其作用可能與PI3K/Akt信號通路有關。