MicroRNA-218、microRNA-193b在宮頸癌組織中的表達及與化療耐藥性的關系*

吳玲姣，鄧潔，徐瑤，彭聰，徐蕾

（成都醫學院第一附屬醫院 婦科，四川 成都 610500）

宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第四大原因，是目前影響全球女性健康的重要難題[1]。數據調查顯示，全球每年約50萬宮頸癌新發病例，我國每年宮頸癌新發病例約12萬，其中4.8萬患者死于宮頸癌[2]。外科手術切除、輔助放化療等綜合治療是目前臨床治療宮頸癌的常用手段。國內外研究已證實化療可顯著改善宮頸癌患者臨床療效，使患者獲得生存收益，但長期使用化療藥物可引起宮頸癌患者出現耐藥現象，降低藥物效價，最終導致宮頸癌細胞復發轉移、病情進展，影響患者預后[3-4]。如何有效抑制化療藥物耐藥已成為宮頸癌治療的關鍵，深入探討宮頸癌患者化療耐藥機制對于尋找宮頸癌治療新手段具有重要意義。

近期研究發現化療藥物耐藥性與microRNA（miRNA）調控的不同耐藥基因表達的變化密切相關[5]。miRNA是一類小的非編碼RNA，由19～29個核苷酸組成，通過堿基配對與靶基因結合調節基因表達，進而調節癌細胞的增殖、分化、凋亡、免疫反應逃避及化療抗性等過程[6]。在宮頸癌中，已證實microRNA-218（miR-218）可作為腫瘤抑制因子調節與腫瘤進展和轉移相關的細胞進程[7]；microRNA-193b（miR-193b）與腫瘤患者抗腫瘤藥物順鉑敏感性密切相關[8]。目前關于miR-218、miR-193b在宮頸癌組織中的表達及其與化療耐藥性的關系尚缺乏報道，本研究探討上述問題，以期為宮頸癌新的治療靶點和預后標志物提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2023年1月成都醫學院第一附屬醫院收治的101例行手術治療的宮頸癌患者。納入標準：①符合《子宮頸癌診斷與治療指南（2021年版）》[9]中宮頸癌診斷標準；②首次確診且行宮頸癌手術，術后行化療；③年齡> 18歲。排除標準：①伴傳染性疾病、血液系統疾病、免疫缺陷；②重要臟器功能障礙；③伴其他部位惡性腫瘤；④醫患溝通障礙；⑤遠處轉移，伴性病、陰道炎等疾病；⑥術前血栓高度風險、術前行放化療；⑦既往有子宮頸手術史；⑧伴手術禁忌證；⑨依從性差、自然失訪。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 手術及取材 參照《子宮頸癌診斷與治療指南（2021年版）》[9]，患者行手術治療（包括保留生育功能手術、不保留生育功能手術、盆腔廓清術、腹主動脈±平羌淋巴結切除分期手術），切除原發病灶，術后行病理檢查確認淋巴結轉移情況，并給予化療。將距腫瘤組織> 2 cm的組織作為癌旁組織。

1.2.2 癌組織化療耐藥性測定 將一部分癌組織標本消化制成細胞懸液后行化療藥物敏感性測定，將腫瘤組織剪成糊狀碎塊，消化酶消化，調整細胞密度為2×104個/mL；取單細胞懸液，接種于96孔培養板（180 μL/孔）中，分別加入藥物終濃度為血漿峰值濃度的紫杉醇（58 mg/L）、順鉑（102 mg/L）、阿霉素（64 mg/L）、5-氟尿嘧啶（82 mg/L）、卡鉑（43 mg/L），設5種測試濃度（測試藥物的0.125、0.250、0.500、1.000、2.000倍），每個濃度設3個復孔。標本在37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養箱中培養3 d，添加10μL 噻唑藍（5 mg/mL）繼續培養4 h后，每孔加入100μL鹽酸異丙醇（0.04 N），靜置10 min，用多功能微孔板檢測儀檢測，計算平均值。腫瘤細胞抑制率=[1-（X-Mi）/（Mo-Mi）]×100%（X、Mo、Mi為熒光強度抑制率），計算出殺傷50%腫瘤細胞所需藥物濃度（IC50）和IC90，將IC90 > 100%測試藥物濃度、IC50 > 25%測試藥物濃度記為耐藥。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測癌組織、癌旁組織miR-218、miR-193b表達 宮頸癌組織和癌旁組織在液氮中研碎，勻漿后使用QIACEN RNeasy Mini試劑盒（日本TaKaRa株式會社）分別提取癌及癌旁組織總RNA，分離miRNA，逆轉錄成cDNA，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應，反應體系20 μL，反應條件：95 ℃預變性5 min，93 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，60 ℃拉伸30 s，共40個循環。內參U6，繪制熔解曲線，CT值為基礎，2-ΔΔCT法計算miR-218、miR-193b相對表達量。見表1。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達量比較

癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05），癌組織中miR-218相對表達量低于癌旁組織，miR-193b相對表達量高于癌旁組織。見表2。

表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達量比較 （n =101，±s）

表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對表達量比較 （n =101，±s）

組織癌旁組織癌組織t 值P 值miR-218 8.04±1.23 3.82±0.47 20.294 0.000 miR-193b 0.47±0.09 2.01±0.38 38.127 0.000

2.2 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況比較

宮頸癌患者對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%（39/101）、46.53%（47/101）、48.51%（49/101）、26.73%（27/101）、40.59%（41/101）。宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑耐藥率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況 例（%）

2.3 不同耐藥宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達量比較

對體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05），耐藥患者癌組織中miR-218相對表達量均低于敏感患者，miR-193b相對表達量均高于敏感患者。見表4。

表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達量比較 （±s）

表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對表達量比較 （±s）

藥物n t 值P 值t 值P 值紫杉醇2.456 0.016 3.002 0.003順鉑4.281 0.000 2.955 0.004阿霉素2.145 0.034 2.559 0.012 5-氟尿嘧啶2.309 0.023 2.278 0.025卡鉑耐藥情況耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感39 62 47 54 49 52 27 74 41 60 miR-218 3.67±0.52 3.91±0.45 3.58±0.57 4.02±0.46 3.69±0.63 3.94±0.54 3.63±0.53 3.89±0.49 3.55±0.58 3.99±0.64 3.523 0.001 miR-193b 2.13±0.35 1.93±0.31 2.09±0.28 1.94±0.23 2.07±0.26 1.95±0.21 2.11±0.33 1.97±0.25 2.16±0.32 1.91±0.22 4.656 0.000

2.4 癌組織miR-218、miR-193b預測宮頸癌患者化療耐藥性的價值

ROC曲線分析結果顯示，miR-218、miR-193b及兩者聯合預測宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性分別為74.51%（95% CI：0.601，0.852）、70.59%（95% CI：0.560，0.821）、82.35%（95% CI：0.686，0.911），特異性分別為74.00%（95% CI：0.594，0.849）、78.00%（95%CI：0.637，0.880）、90.00%（95% CI：0.774，0.963），曲線下面積分別為0.754（95% CI：0.661，0.847）、0.743（95% CI：0.643，0.843）、0.890（95% CI：0.824，0.956）。見圖1和表5。

圖1 癌組織中miR-218、miR-193b表達預測宮頸癌患者化療耐藥性的ROC曲線

表5 癌組織中miR-218、miR-193b表達預測宮頸癌患者化療耐藥性的效能

3 討論

宮頸癌的一線化療藥物多為鉑類化合物、紫杉烷類等，順鉑的作用機制是基于鏈內和鏈間DNA交聯的形成，順鉑可通過抑制DNA復制、RNA轉錄，最終導致癌細胞死亡，ABC家族的藥物轉運蛋白異常表達可造成順鉑回流增加，或有機陰離子轉運蛋白表達減少，導致順鉑攝取減少，在細胞內順鉑又可以被含巰基的分子滅活，致使癌細胞對順鉑敏感性降低；紫杉醇可與β-微管蛋白亞基結合，從而穩定微管并阻斷有絲分裂，細胞分裂受阻，從而導致癌細胞凋亡，紫杉醇耐藥性中最重要的因素為ABC家族的藥物轉運蛋白的過度表達；此外致密的細胞結構和細胞外基質的豐富表達可限制化療藥物滲透到癌組織中；miRNA是調節基因表達的表觀遺傳機制，其耐藥機制的產生均與miRNA調節的耐藥基因表達改變有關[10]。宮頸癌中miRNA概況的體內外研究也表明，與耐藥細胞系/組織相比，敏感細胞系/組織中miRNA的特征發生了明顯變化[11]。miRNA可通過堿基配對與靶基因結合，轉錄后可調節多個基因的表達使靶基因降解或抑制靶基因翻譯，miRNA能夠通過識別目標mRNA的3'-非翻譯區末端的非必要互補序列來與許多基因結合，控制基因表達并影響細胞代謝、增殖、DNA修復和細胞凋亡等過程。miRNA作為腫瘤抑制因子或致癌基因，調節大量基因和信號通路，可用于預測宮頸癌患者對化療的反應，是預測治療反應的合適生物標志物。

本研究結果顯示，癌組織中miR-218相對表達量低于癌旁組織，miR-193b相對表達量高于癌旁組織，說明miR-218、miR-193b表達與宮頸癌發生關系密切。miRNA在許多細胞穩態功能中起著重要作用，在調節包括分化、血管生成和細胞周期在內的多種信號通路和生物過程中起核心作用。因此miRNA表達的改變與包括癌癥在內的大量疾病有關。在癌細胞中，miRNA可作為抑癌基因或致癌基因，抑癌miRNA可通過負調控癌基因的表達來抑制腫瘤的發展，且在癌細胞中表達降低；致癌基因在癌細胞中表達上調，并通過抑癌基因的負調節促進腫瘤發展。

本研究結果顯示，101例宮頸癌患者行體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%、46.53%、48.51%、26.73%和40.59%，提示宮頸癌患者化療耐藥風險較高。越來越多的證據指出，miRNA在包括宮頸癌、卵巢癌在內的各種癌癥的耐藥性方面發揮著重要作用。耐藥患者癌組織中miR-218相對表達量低于敏感患者，miR-193b相對表達量高于敏感患者，提示miR-218、miR-193b表達與宮頸癌患者化療耐藥有關。miR-218作為一種抑癌基因，上調miR-218表達可通過靶向下調蛋白磷酸酶甲酯e1、cyclin E2/smc4、磷脂酰膽堿酰基轉移酶1進而抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。miR-218通過靶向Glut1k可增加膀胱癌對順鉑的敏感性[12]；miR-218-5p通過prkce/Mdr1軸調控膽囊癌對吉西他濱的敏感性[13]；miR-218通過調控ppp2r5a/Wnt信號通路促進口腔癌順鉑耐藥[14]；miR-218-5p靶向EGln3抑制肺腺癌增殖、遷移和侵襲[15]。筆者推測miR-218可能通過多種信號通路途徑調節宮頸癌患者基因和信號通路，進而介導化療藥物耐藥性。GRABOWSKA等[16]研究顯示，膠質母細胞腫瘤中miR-218的減少影響細胞外基質組成和細胞生物力特征，細胞外基質及膠質母腫瘤細胞剛性的變化可促進腫瘤細胞侵襲。CRUZ-de la ROSA等[11]研究顯示，miR-218-5p/Runx2軸正向調節增殖與宮頸癌的不良預后相關。吳雄健等[17]研究顯示，上調miR-218/Nedd9軸可誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲。王旭等[18]研究指出，miR-218-5p可靶向血管內皮生長因子A基因促進宮頸癌HeLa細胞凋亡并抑制遷移。李正雄等[19]研究顯示，長鏈非編碼RNA鐵蛋白重鏈1假基因3靶向miR-218促使其表達下調，可降低人肺癌順鉑耐藥細胞對順鉑的化療敏感性。

Polo樣激酶1是細胞周期進程和細胞凋亡的關鍵調節劑，miR-193b-5p可通過靶向Polo 樣激酶1 mRNA的3'-端非編碼區，抑制Polo樣激酶1表達，miR-193b-5p過表達可通過抑制Polo樣激酶1誘導細胞凋亡，HapMap細胞系中，miR-193b過表達會增加卡鉑和順鉑的耐藥性[20]。Bcl-2家族蛋白介導的細胞凋亡在癌細胞獲得性化療耐藥性中起關鍵作用，髓樣細胞白血病-1是抗凋亡Bcl-2家族蛋白的重要成員，在預后不良的人類癌細胞中過表達，miR-193b可通過下調髓樣細胞白血病-1來調節人乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性[21]；筆者推測miR-193b可能通過調節宮頸癌患者基因和信號通路表達，進而介導化療藥物耐藥性，但具體作用機制仍需后期進一步探討。陳晨晨等[22]研究指出，miR-193b的表達與子宮內膜癌的發生、發展、轉移和侵襲能力密切相關，且miR-193b可通過靶向于Mcl-1增強紫杉醇對子宮內膜癌細胞的殺傷效力。杜文霞等[23]研究指出，miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達，沉默miR-193b可增加HeLa細胞對順鉑的敏感性，作用機制可能與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有關。miR-193b的表達與腫瘤直徑以及淋巴結轉移和遠處轉移的可能性有關[24]；外泌體miR-193b-3p通過靶向Zbtb7a促進精原細胞瘤中的順鉑敏感性[8]。ROC曲線結果顯示，miR-218聯合miR-193b預測宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性、特異性、曲線下面積最高，提示miR-218聯合miR-193b預測宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-218表達低于癌旁組織、miR-193b表達高于癌旁組織，miR-218、miR-193b的表達水平與宮頸癌患者化療耐藥性有關，兩者聯合預測宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。后期仍需更多臨床與基礎研究進一步驗證本研究結論。