二甲雙胍通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結直腸癌的機制研究*

穆劉凡，黃煌，鄭鵬遠，米陽，劉思濛，梅璐，榮康，南夢嬌

（鄭州大學第五附屬醫院 消化內科，河南 鄭州 450052）

根據世界衛生組織2020年公布的數據，在世界范圍內結直腸癌在所有惡性腫瘤中發病率排第3位，而病死率排第2位[1]。2020年結直腸癌在我國所有惡性腫瘤中的發病率排第3位（0.239‰），病死率排第5位（0.12‰）[2]。目前臨床對結直腸癌采用以手術為主的綜合治療，包括化學治療、放射治療、靶向治療、免疫治療等，但其術后轉移率仍較高。在大多數情況下，轉移性結直腸癌仍是一種無法治愈的疾病。也是導致患者死亡的常見原因[3]。既往研究發現，環氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）的過表達與結直腸癌發生相關[4]。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是COX-2的主要下游催化產物，在結直腸癌中也發揮著關鍵作用，其通過刺激前列腺素E2受體信號傳導，促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進血管生成[5]。目前已證明在前列腺癌、肺癌和膽管癌中，活化的COX-2/PGE2和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）信號傳導途徑之間存在緊密關系[6-8]。近年來有學者發現，用于治療2型糖尿病的經典口服藥物二甲雙胍（Metformin）具有降低惡性腫瘤發病率及改善惡性腫瘤患者生存預后的作用[9]。研究表明，二甲雙胍能夠通過抑制COX2/PGE2/STAT3途徑來抑制前列腺癌細胞上皮間質轉換（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[10]；通過激活AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）來抑制COX-2的產生，并抑制乳腺癌細胞的增殖[11]；通過COX2/PGE2/STAT3途徑抑制癌癥干細胞再繁殖，從而抑制膀胱癌的進展[12]。綜上所述，結直腸癌疾病負擔較重，是當前腫瘤領域的研究熱點。本研究旨在探索二甲雙胍是否可以通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結直腸癌的發生、發展。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、動物及主要試劑

人結腸癌細胞SW480和小鼠結腸癌細胞MC38購自中國科學院典型培養物寶藏委員會細胞庫；28只7周齡無特定病原體級雄性C57BL/6N小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2020-0008]。在恒壓、恒溫、恒濕條件下喂養，每日光照12 h，使用輻照滅菌維持飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）喂養。動物研究方案已得到鄭州大學第五附屬醫院動物倫理委員會批準同意（倫理編號：KY2022046）。

CCK-8試劑盒（廣州Biosharp公司，批號：BS350C），凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，編號：KGA108），二甲雙胍（上海麥克林生化科技有限公司，編號：M813341），氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）（美國Sigma公司，批號：A5486），葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt,DSS）（美國MP Biomedicals公司，編號：02160110-CF）。COX-2一抗（英國Abcam公司，批號：ab179800），磷酸化轉錄激活因子3一抗（p-signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3）（英國Abcam公司，編號：ab76315），STAT3一抗（英國Abcam公司，批號：ab68153），酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢Elabscience公司，批號：E-IR-R212），中國上海博谷生物科技有限公司，批號：HEP016）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MC38細胞在含有10%胎牛血清、100 μL/mL鏈霉素、100 μL/mL青霉素的1640培養基中培養；SW480細胞在含有10%胎牛血清、100 μL/mL鏈霉素、100 μL/mL青霉素的DMEM培養基中培養。兩種結直腸癌細胞均在37 ℃、5%二氧化碳和高濕度的培養箱中生長。將含有細胞的培養皿放置在顯微鏡樣品臺上，使培養皿位于鏡頭下方。調節焦螺旋，使視野清晰度達到最佳，通過顯微鏡觀察細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 將兩種結直腸癌細胞（5×103個/孔）分別接種到96孔板上，加入100 μL培養基，貼壁后，用不同濃度（0、5、10、20、30和40 mmol/L）的二甲雙胍處理24 h，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。即將CCK-8試劑加入細胞，并孵育2 h，在450 nm波長處測定光密度值（optical density,OD）。細胞活力=（ODn-OD0）/（ODc-OD0）×100%（OD0：空白；ODc：未處理對照；ODn：二甲雙胍處理）。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將兩種結直腸癌細胞（2×105個/孔）分別接種到6孔板上，用20 mmol/L二甲雙胍處理48 h，收集細胞培養基中的細胞，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞。用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，以2 000 r/min離心5 min，加入500 μL的Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide，混勻，避光孵育10 min，用流式細胞分析儀（美國BD公司）對染色細胞進行分析，計數細胞凋亡比例。

1.3 模型復制

1.3.1 動物實驗分組 采用完全隨機法將小鼠分為生理鹽水對照組（NaCl組）、造模組（AOM + DSS組）、治療組（AOM + DSS + Met組）、二甲雙胍對照組（Met組），分別有6、8、8和6只。

1.3.2 復制結直腸癌小鼠模型 小鼠適應性喂養1周后，于第9周單次腹膜內注射AOM（10 mg/kg）；第10周，動物飲用水中加入2% DSS，持續5 d；第11、12周正常飲用水；第13周動物飲用水中加入2% DSS，持續5 d；第14、15周正常飲用水；第16周動物飲用水中加入2% DSS；第17、18周正常飲用水；第19周處死小鼠[13]。

1.3.3 干預措施 在第10周進行藥物干預。NaCl組、AOM + DSS組均用0.9% NaCl溶液300 μL/（d·只）灌胃處理，AOM + DSS + Met組、Met組均用二甲雙胍250 mg/（kg·d·只）灌胃處理，具體干預措施見圖1。干預期間小鼠保持基礎飲食。第19周，小鼠空腹12 h后，以4%水合氯醛400 mg/kg腹腔麻醉后，眼球取血，處死小鼠，分離結腸組織，進行下一步研究。

圖1 小鼠模型復制及處理

1.4 二甲雙胍活性成分-靶點分子對接

為觀察二甲雙胍進入機體后能否與機體的COX-2靶蛋白結合進而發揮藥效。筆者以“Metformin”為檢索詞在PubChem數據庫中搜索二甲雙胍的分子結構，下載SDF格式的3D Structures，通過RCSB PDB數據庫篩選COX-2的最佳蛋白結構，并下載PDB格式文件。借助PyMOL對核心基因蛋白結構進行除水、去配體等操作，通過OpenBabel將二甲雙胍的SDF格式轉換為mol2格式。運行AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接，搜集結合能分值，最后利用PyMOL進行可視化分析。

1.5 蘇木精-伊紅染色觀察細胞形態

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色操作如下。截取部分結腸組織，甲醛固定，石蠟包埋，切片。組織切片分別放于二甲苯、無水乙醇中脫蠟、脫苯。從蒸餾水中取出后，放入蘇木精溶液中染色10～30 min；將切片放入1%的鹽酸酒精數秒至切片變紅即可，流水沖洗使切片返藍；再次脫水處理；用0.5%伊紅乙醇溶液染色2～5 min；切片脫水透明。將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片，做好標記便于后續觀察。

1.6 免疫組織化學染色觀察結腸組織病理變化

截取部分結腸組織，用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。組織切片分別放于二甲苯、無水乙醇中脫蠟、脫苯；加入檸檬酸鈉抗原修復15 min。用3%過氧化氫去離子水和山羊血清依次封閉15 min，兔COX-2一抗（1∶500）4 ℃溫育過夜。次日洗去一抗，采用50 μL生物素化二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素依次溫育20 min，二氨基聯苯胺染色2 min，蘇木精復染細胞核1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。空白對照組使用抗體稀釋液溫育，其余處理相同。

1.7 Western blotting檢測COX-2、STAT3、p-STAT3蛋白表達

按照試劑盒說明書的方法制備電泳凝膠，電泳按照110 V、90 min一步法進行，結束后取出凝膠，制作轉膜三明治結構，按300 mA、90 min恒流電轉。取出硝酸纖維素膜，置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，分別加入鼠GAPDH抗體（1∶10 000）、兔COX-2抗體（1∶4 000）、兔p-STAT3抗體（1∶10 000）、兔STAT3抗體（1∶1 500），4 ℃溫育過夜。次日回收一抗，充分清洗后二抗室溫孵育1 h，結束后充分清洗，曝光儀（美國Bio-RAD公司）曝光拍照分析。

1.8 酶聯免疫吸附試驗檢測PGE2表達

采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測細胞上清液以及動物血清中的PGE2表達。細胞：將兩種結直腸癌細胞（2×105細胞/孔）分別接種到6孔板上，用20 mmol/L二甲雙胍處理24 h，收集培養基，離心取上清。動物：收集動物眼球血，離心后收取上清液。

1.9 糞便16S rDNA測序

送檢前在超凈工作臺內將糞便樣本整合，每個樣本3～5粒糞便，每組樣本分別放入密封袋內，置于干冰，避免污染，同時標記樣本類型、組別和編號，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，進行16S rDNA測序。

1.10 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0統計軟件，作圖使用GraphPad Prism 8.0和Adobe Photoshop軟件。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數間距M（P25，P75）表示，比較用單因素方差分析、t檢驗或Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較用LSD-t檢驗或Wilcoxon檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍與COX-2蛋白核心成分有較好的結合活性

使用AutoDockTools 1.5.6軟件，將二甲雙胍與COX-2蛋白核心成分進行分子對接，判斷二甲雙胍進入機體后能否與COX-2蛋白核心成分穩定結合。軟件的分子對接結果是以能量的高低來判斷二甲雙胍與靶蛋白結合程度。獲得的連接能量為-5.44 kJ/moL。一般認為連接能量< -5 kJ/moL表示化合物與靶點之間結合活性較好。分子對接結果表明二甲雙胍與COX-2蛋白核心靶點之間結合活性較好。見圖2。

圖2 成分-靶點對接相互作用模式圖

2.2 二甲雙胍可抑制結腸癌細胞增殖并促進其凋亡

使用不同濃度的二甲雙胍分別處理MC38細胞和SW480細胞24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態變化。可以看到，隨著二甲雙胍濃度的增加，腫瘤細胞數量明顯減少。見圖3。

圖3 MC38、SW480細胞添加不同濃度二甲雙胍后的形態 （×40）

CCK-8法結果表明，隨著二甲雙胍濃度的增加，2種結直腸癌細胞活性率受到抑制（見表1）。隨后，筆者又檢測了二甲雙胍對結直腸癌細胞凋亡情況的影響，MC38細胞加入0、20 mmol/L二甲雙胍的細胞凋亡率分別為（4.13±0.26）%、（12.59±0.65）%，SW480細胞分別為（5.31±2.13）%、（32.76±7.26）%。2種結直腸癌細胞細胞凋亡率比較，差異均有統計學意義（t=-36.197和-10.883，均P=0.000），加入20 mmol/L二甲雙胍后結直腸癌細胞的凋亡率明顯增加。見表1。

表1 兩種結直腸癌細胞不同濃度二甲雙胍影響下細胞活性率比較 （%，±s）

表1 兩種結直腸癌細胞不同濃度二甲雙胍影響下細胞活性率比較 （%，±s）

細胞MC38細胞SW480細胞0 mmol/L 100.42±8.26 100.00±3.19 5 mmol/L 82.31±5.79 94.36±3.84 10 mmol/L 77.85±4.85 92.06±2.13 20 mmol/L 73.89±2.46 88.32±4.92 30 mmol/L 70.44±4.00 85.80±3.70 40 mmol/L 68.44±4.53 81.56±3.08

2.3 二甲雙胍可在體外通過COX2/PGE2/STAT3途徑抑制結直腸癌細胞增殖并促進其凋亡

0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細胞后COX-2蛋白相對表達量分別為（0.89±0.19）、（0.59±0.38）、（0.36±0.18）、（0.17±0.04），0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細胞后COX-2蛋白相對表達量分別為（1.01±0.16）、（0.83±0.18）、（0.53±0.14）、（0.44±0.24）。不同濃度二甲雙胍處理MC38、SW480細胞后COX-2蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=5.460、6.574，P=0.024、0.015）。二甲雙胍干預可抑制COX-2蛋白的表達，且隨著濃度的增加，COX-2蛋白表達呈藥物劑量依賴性減低。見圖4。

圖4 MC38、SW480細胞添加不同濃度二甲雙胍后COX-2蛋白的表達情況

0、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細胞后PGE2水平分別為（7.40±0.14）、（6.16±0.07）pg/mL，0、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細胞后PGE2水平分別為（7.91±0.36）、（3.82±0.10）pg/mL。不同濃度二甲雙胍處理MC38、SW480細胞后PGE2水平比較，差異有統計學意義（t=13.853、18.778，均P=0.000）。0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理MC38細胞后p-STAT3相對表達量分別為（1.17±0.26）、（0.87±0.32）、（0.60±0.33）、（0.51±0.24）pg/mL，0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理SW480細胞后p-STAT3相對表達量分別為（1.14±0.19）、（0.78±0.08）、（0.45±0.07）、（0.24±0.11）pg/mL。不同濃度二甲雙胍處理MC38細胞后p-STAT3相對表達量比較，差異無統計學意義（F=3.164，P=0.086）。不同濃度二甲雙胍處理SW480細胞后p-STAT3相對表達量比較，差異有統計學意義（F=32.626，P=0.000）。二甲雙胍的干預可以降低STAT3的磷酸化，且隨著濃度的增加，p-STAT3相對表達量逐漸減低，但對STAT3相對表達量無抑制作用（見圖5）。說明二甲雙胍可以通過COX2/PGE2/STAT3途徑對結腸癌細胞發揮抑制作用。

圖5 MC38、SW480細胞添加不同濃度二甲雙胍后p-STAT3、STAT3蛋白的表達情況

2.4 二甲雙胍干預可抑制結直腸癌小鼠的腫瘤生長、分化

2.4.1 各組小鼠腫瘤數量、體積及結腸長度比較NaCl組和Met組小鼠結腸外觀無明顯異常，而AOM +DSS組和AOM + DSS + Met組小鼠結腸腔內可看到個數及體積不等的腫瘤。見圖6。

圖6 各組小鼠結腸外觀

各組小鼠結腸腫瘤數量、腫瘤體積及結腸長度比較，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結果顯示，AOM + DSS組較NaCl組腫瘤數量增多、體積增大、結腸長度縮短（P<0.05），AOM + DSS + Met組較Nacl組結腸腫瘤數量增多、體積增大、結腸長度縮短（P<0.05），AOM + DSS + Met組較AOM + DSS組結腸腫瘤數量減少、腫瘤體積減小（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結腸腫瘤數量、腫瘤體積及結腸長度比較（±s）

表2 各組小鼠結腸腫瘤數量、腫瘤體積及結腸長度比較（±s）

組別NaCl組AOM + DSS組AOM + DSS + Met組Met組F 值P 值腫瘤數量/個0.00±0.00 4.25±2.63 2.38±1.60 0.00±0.00 10.083 0.000腫瘤體積/mm 0.00±0.00 4.89±2.62 3.15±1.37 0.00±0.00 14.661 0.000結腸長度/mm 88.68±7.27 73.78±8.10 78.67±4.34 86.71±6.73 5.130 0.010

2.4.2 HE染色結果分析 NaCl組和Met組小鼠結腸低倍鏡下觀察無異常，高倍鏡下可見成型的腺體規則排列，腺體厚度無明顯改變，細胞形狀規則，細胞核清晰可見，并可見大量的杯狀細胞。AOM +DSS組小鼠結腸低倍鏡下觀察可見到明顯的外生型腫瘤；高倍鏡下，大部分腺體排列紊亂，異型增生明顯。部分異形細胞成團聚集，腺體形狀不可明視。細胞核異型性明顯，核大深染，邊界不清。與AOM+DSS組比較，AOM+DSS+Met組小鼠結腸低倍鏡下未見腫瘤生長，高倍鏡下可見部分腺體排列紊亂，但腺體輪廓大致可見，腺體結構可見。見圖7。

2.4.3 二甲雙胍降低結直腸癌小鼠結腸組織COX-2、PGE2及p-STAT3相對表達量 NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠COX-2蛋白相對表達量分別為（0.40±0.10）、（1.00±0.03）、（0.55±0.18）、（0.14±0.02），經方差分析，差異有統計學意義（F=48.404，P=0.000）。AOM + DSS組COX-2蛋白的表達較NaCl組和Met組高。AOM + DSS + Met組COX-2蛋白的表達較AOM + DSS組低，但仍高于Nacl組和Met組。見圖8。

圖8 各組小鼠結腸組織COX-2蛋白的表達

免疫組織化學結果顯示，AOM + DSS組COX-2高表達，用二甲雙胍處理后，AOM + DSS + Met組COX-2表達降低，NaCl組和Met組幾乎不表達。見圖9。

圖9 各組小鼠結腸COX-2蛋白免疫組織化學染色

NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠PGE2蛋白水平分別為（1.00±0.53）、（11.16±1.18）、（5.53±1.22）、（0.29±0.10）pg/mL，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=119.555，P=0.000）。進一步兩兩比較結果發現，AOM + DSS +Met組PGE2蛋白水平較AOM + DSS組低，但高于NaCl組和Met組（P<0.05）。

NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠STAT3蛋白相對表達量分別為（1.03±0.19）、（1.03±0.13）、（0.78±0.18）、（1.15±0.74），經方差分析，差異無統計學意義（F=3.301，P=0.079）。NaCl組、AOM + DSS組、AOM + DSS + Met組、Met組小鼠p-STAT3蛋白相對表達量分別為（0.20±0.22）、（1.06±0.09）、（0.59±0.21）、（0.06±0.05），經方差分析，差異有統計學意義（F=23.535，P=0.000）。在體內實驗中，AOM + DSS組p-STAT3表達量較NaCl組、Met組高，較AOM + DSS組低（P<0.05）。而各組小鼠STAT3蛋白相對表達量無明顯差異。結果表明，二甲雙胍的干預可以降低STAT3的磷酸化，而對STAT3總蛋白的表達沒有抑制作用。見圖10。

圖10 各組小鼠結腸組織p-STAT3、STAT3蛋白的表達

2.5 結直腸癌小鼠腸道菌群16S rDNA高通量測序

2.5.1 高通序質量評價 共收集到25個樣本，其中NaCl組6個，AOM+DSS組5個，AOM+DSS+Met組8個，Met組6個。共獲得967 272條優化序列，序列平均長度為418 bp，共得到11門15綱42目73科159屬256種660個操作分類單元。Sobs指數升高代表菌群豐度增加，多樣性指數（Shannon指數）表示菌群多樣性。Shannon指數稀釋曲線趨向平坦，達到平臺期，說明測序數據量足夠大，該測序深度可覆蓋全部物種。可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。見圖11。

圖11 各樣本多樣性指數稀釋曲線

2.5.2 屬水平PCoA多樣性分析及指數組間差異性檢驗 不同顏色或形狀的點代表不同分組的樣本，兩樣本點越接近，表明兩樣本組成越相似。可以看出，在屬水平上，NaCl組與Met組物種組成基本一致，而NaCl組，AOM+DSS組，AOM + DSS + Met組之間的物種組成均有所差異。見圖12。

圖12 屬水平PCoA多樣性分析

NaCl組Sobs指數為354.00（313.75，386.25），AOM+DSS組Sobs指數、Shannon指數分別為284.00（237.50，306.00）、3.765（3.357，3.908），AOM+DSS+Met組分別為365.50（348.50，382.25）、4.048（3.941，4.215）。NaCl組與AOM + DSS組Sobs指數比較，差異有統計學意義（Z=-2.191，P=0.028），AOM+DSS組較NaCl組低。AOM + DSS組與AOM+DSS+Met組Sobs指數、Shannon指數比較，差異有統計學意義（Z=-2.739和-2.373，P=0.006和0.018），AOM+DSS+Met組較AOM+DSS組高（P<0.05）。表明二甲雙胍治療會使菌群豐度以及多樣性增加。

2.5.3 各組物種門水平、屬水平群落豐度比較 各組放線菌門、變形菌門、髕骨細菌門、內臟臭氣桿菌屬、普雷沃菌屬、雙歧桿菌屬、糞厭氧棒桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬群落豐度比較，差異有統計學意義（P<0.05）。NaCl組與AOM + DSS組放線菌門、普雷沃菌屬群落豐度比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。NaCl組與AOM + DSS + Met組變形菌門、糞厭氧棒桿菌屬、內臟臭氣桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬群落豐度比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。AOM + DSS組與AOM + DSS + Met組變形菌門、放線菌門、糞厭氧棒桿菌屬、埃希氏-志賀氏菌屬、普雷沃菌屬群落豐度比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。NaCl組與Met組放線菌門、髕骨細菌門、變形菌門、雙歧桿菌屬群落豐度比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組物種門水平、屬水平群落豐度比較 M（P25，P75）

3 討論

在全球范圍內結直腸癌的發病率和病死率逐年上升。預計到2030年全球發病率將增加60%[14]，嚴重影響患者的生活質量，并且給社會帶來極大的疾病負擔。目前臨床對于結直腸癌多采用以手術為主的治療，但術后轉移率高。結直腸癌目前已成為亟待解決的公共衛生問題，研究者也在積極探討有效的治療方法及藥物。本研究結果證實了二甲雙胍在體內和體外均可以抑制結直腸癌的生長和分化，并闡明了這種抑制作用是通過COX-2/PGE2/STAT3途徑來實現的。

本研究結果首先證實了二甲雙胍與COX-2具有較高的結合活性。然后使用不同濃度的二甲雙胍分別對小鼠結腸癌細胞系MC38和人結腸癌細胞系SW480進行處理，結果表明，二甲雙胍可以抑制兩種結腸癌細胞的生長和增殖，促進結腸癌細胞的凋亡。同時，二甲雙胍還可以抑制兩種結直腸癌細胞系COX-2、PGE2以及p-STAT3的表達。接下來，筆者使用AOM和DSS誘導的結直腸癌的小鼠模型，二甲雙胍干預后進行取材分析，發現二甲雙胍也可以減少腫瘤的數量以及體積。同樣，筆者檢測了小鼠結腸中COX-2、PGE2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達情況，與體外實驗的結果一致，二甲雙胍也可以抑制小鼠結腸組織中COX-2、PGE2以及p-STAT3的表達，但不影響STAT3蛋白的含量。

有臨床研究表明，二甲雙胍也可降低直腸癌新輔助同步放化療患者中癌癥復發的風險[15]。而其對于結直腸癌的抑制作用可能是通過以下機制發生的：二甲雙胍可以通過AMPK和胰島素/胰島素樣生長因子途徑靶向作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，抑制結直腸腫瘤的發生、發展[16-17]；SABER等[18]證明二甲雙胍與5-氨基水楊酸組合可抑制炎性介質，如白細胞介素-1β、白細胞介素-6、COX-2等，滅活核因子κB和STAT3進一步降低基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9的表達，減少結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力；二甲雙胍可以使細胞周期停滯[19]。而本研究闡明了二甲雙胍抑制結直腸癌的新途徑：二甲雙胍可以通過COX-2/PGE2/STAT3信號通路來抑制結直腸癌的發生、發展。COX-2是催化花生四烯酸轉化為PGE2的一種限速酶，PGE2作為COX-2的下游產物，能促進腫瘤細胞生長、遷移和侵襲，促進血管生成，并抑制腫瘤細胞凋亡。有文獻表明，在結直腸腫瘤中，COX-2/PGE2與STAT3關系密切[20]。p-STAT3蛋白變構后可轉移到細胞核內，參與調節腫瘤細胞的生長、凋亡和轉移等[21]。并且有研究者發現，PGE2抑制劑如非甾體抗炎藥可通過抑制COX-2/PGE2途徑降低結直腸癌的發生[22]。本研究結果發現，二甲雙胍也可以通過COX-2/PGE2通路抑制結直腸癌的生長，這種作用是通過抑制STAT3的磷酸化來實現的。而已有的研究表明，在前列腺癌[10]、膀胱癌[12]中，二甲雙胍均可以抑制COX-2/PGE2/STAT3信號通路來抑制腫瘤的遷移和侵襲，這與本研究結果是一致的，提示這可能是二甲雙胍發揮抗腫瘤作用的機制之一。結直腸癌主要包括三種來源：散發性、遺傳性、與結腸炎相關，其中85%～90%的散發性結直腸癌均來源于腺瘤-腺癌途徑[23]。從腺瘤發展到腺癌需要數年的時間，除了生活方式的干預，化學預防也是一個重要手段。本研究結果表明，使用二甲雙胍干預的小鼠模型，結直腸癌生長的數量、體積以及細胞異型性均顯著低于實驗組。而HIGURASHI等[24]研究也表明，口服二甲雙胍（250 mg/d）的結腸息肉量和腺瘤發生的概率明顯低于安慰劑組（38.0% vs 56.6%，30.6%vs 51.6%）。且二甲雙胍價格低廉、易獲得、副作用小，是很有潛力的化學預防藥物。

腸道由豐富多樣的微生物群落組成，統稱為“腸道微生態”[25]。腸道微生態組成的改變被認為是一種生態失調，與許多人類疾病有關，包括腫瘤[26]。結直腸癌的已知危險因素，如飲食習慣、吸煙、肥胖等[27-28]，可以改變腸道微生態的組成。因此，研究者推測，某些結腸微生物或原籍菌的改變可能產生促進腫瘤發生、發展的微環境。有證據表明，二甲雙胍會引起人類腸道微生物群（如腸道細菌豐度降低）和腸道代謝組（如丁酸鹽產生增加）的顯著變化[29-30]。而其是否能夠通過改變腸道菌群來抑制結直腸腫瘤的發生、發展，還需進一步闡明。因此，本研究16S rDNA測序結果顯示，AOM+DSS組的群落豐度減少，而經過二甲雙胍治療后，群落豐度有所增加。在成人中，正常腸道菌群的主要細菌門是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，前2個在健康成人中普遍存在[31]；而主要的細菌屬是厭氧菌屬，如擬桿菌屬、真桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬和糞桿菌屬。大多數厚壁菌門是革蘭氏陽性細菌，可以水解腸道中的碳水化合物和蛋白質。擬桿菌門主要有助于多糖吸收和蛋白質合成的類固醇、多糖和膽汁酸，其成員可以將腸道中的多糖分解為短鏈脂肪酸，從而增加腸黏膜的通透性并促進炎癥，兩者相輔相成，促進宿主體內能量的吸收。本研究結果中，在門水平上，與NaCl組相比，AOM+DSS組的小鼠放線菌門平均相對豐度明顯下降，而與AOM+DSS組相比，AOM+DSS+Met組的小鼠變形菌門、放線菌門的平均相對群落豐度增加，表明二甲雙胍可以改善腸道菌群，使之趨向正常化。丁酸梭菌是一種來自轉基因的益生菌，通過在腸道中發酵纖維來產生丁酸鹽。而有文獻指出，丁酸鹽處理可以顯著降低小膠質細胞COX-2水平[32]。本研究尚未發現二甲雙胍與丁酸梭菌的關系，在后續研究中筆者將進一步展開探索。

綜上所述，二甲雙胍可以通過COX-2/PGE2/STAT3途徑抑制結直腸癌的發生、發展，促進腫瘤細胞的凋亡；另外，二甲雙胍可以促使結直腸癌模型小鼠的腸道菌群向正常菌群改變。雖然其臨床有效性、安全性還有待進一步探討，但基于以上研究成果，二甲雙胍有望成為一種新型的預防、輔助治療結直腸癌的藥物。