基于DMC 法的α-氨基酸-N-環內酸酐的綠色合成

李振環，彭日麗，蘇坤梅

（1.天津工業大學材料科學與工程學院，天津 300387；2.天津工業大學化學工程與技術學院，天津 300387）

氨基酸聚合物具有良好的降解性和生物相容性，是有極大發展潛能的生物醫用高分子材料[1]，作為藥物遞送載體[2]、生物分子沉淀劑[3]、抑菌材料[4]等在醫藥化學領域被廣泛應用。α-氨基酸-N-環內酸酐（NCAs）是合成多肽的重要中間體，利用NCAs 可快速簡便地合成固定序列的聚氨基酸[5]，因此，NCAs 的合成研究被廣泛關注[6-7]。

Boiteau 等[8]以N-氨基甲酰胺為原料發生亞硝化反應，失去氮氣和水后得到L-纈氨酸-N-羧基環內酸酐（Val-NCA），產率高達95%。Semple 等[9]發現在N2氣氛下，γ-芐基-L-谷氨酸加入三光氣反應后，在乙酸乙酯與正己烷中重結晶得到的NCA 收率可達85%。Wang 等[10]在氨基酸-四氫呋喃懸浮液中加入雙光氣后，用硅藻土去除副產物氯化氫，可規模產出多種NCAs。Koga 等[11]以兩性離子形式將3 種氨基酸轉換為對應的咪唑鹽后，在乙腈中與碳酸二苯酯結合生產氨基甲酸酯衍生物，最后加入甲酸環化成NCAs，產率在75%以上。但上述方法均有毒性大、對環境不友好的缺點[12]。碳酸二甲酯（DMC）作為一種無毒綠色試劑，具有化學活性高和廉價易得的優點[13]，是一種良好的甲氧羰基化試劑[14]，是代替光氣合成NCAs 的更好選擇。本課題組早前將DMC 作為環化劑，嘗試了N-羧基丙氨酸酸酐（Ala-NCA）[15]與L-谷氨酸-γ-芐酯-N-羧酸酐（BLGNCA）[16]的合成，有產率較低或操作復雜的局限性。

基于以上問題，本文以乙酸鋅為催化劑，采用“一鍋法”合成L-苯丙氨酸-N-羧基環內酸酐（Phe-NCA）、Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸環內酸酐（Cbz-Lys-NCA）和L-天冬氨酸-4-芐酯－羧基環內酸酐（H-Asp-Obzl-NCA），考察反應溫度、反應物比例等因素對氨基酸轉化率與NCAs 產率的影響，并對乙酸鋅在反應過程中的催化作用進行分析，以期為氨基酸聚合物的綠色合成提供參考。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與設備

主要原料與試劑：苯丙氨酸（Phe）、L-天冬氨酸-4-芐酯（H-Asp-Obzl）、Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸（Cbz-Lys）、無水乙酸鋅、無水碳酸鈉，均為上海麥克林生化科技股份有限公司產品；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、DMC，均為天津科密歐化學試劑有限公司產品，使用前采用4A 分子篩進行除水處理。

設備：LC-210 型高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司產品；ELSD-2000 型蒸發光散射檢測器，美國奧泰科技（中國）有限公司產品；AVANCE III HD 400 MHz 型液體核磁共振波譜儀、D8 ADVANCE型X-射線衍射分析系統，均為德國布魯克公司產品；NEXSA 型X 射線光電子能譜儀，Nicolet Is 50 型傅里葉紅外光譜儀，均為美國賽默飛科技有限公司產品；SCION 456-TQ 型氣相色譜-質譜聯用分析系統，德國SCION 儀器有限公司產品。

1.2 α-氨基酸-N-環內酸酐的制備

α-氨基酸-N-環內酸酐的合成路線如圖1 所示。

圖1 NCAs 的合成路線Fig.1 Synthetic route of NCAs

分別稱取5 mmol 的氨基酸（Phe 0.825 g、H-Asp-Obzl 1.11 g、Cbz-Lys 1.40 g）加入三口燒瓶中，再加入50 mL 處理后的DMF 溶劑，在冷凝回流的條件下加熱攪拌，使氨基酸在適宜溫度下溶解。稱取7.5 mmol（0.795 g）的Na2CO3和1 mmol（0.18 g）Zn（OAc）2加入三口燒瓶，再倒入一定體積的DMC，通N2去除三口燒瓶中的空氣，再用生料帶密封瓶塞處，繼續加熱2～10 h。反應結束后，趁熱抽濾得到澄清溶液，再先后加入適量的正己烷與乙酸乙酯，密封置于-2 ℃下48 h，析出淡黃色固體，過濾，冷凍干燥后即得到產物NCAs。最后對反應濾液進行減壓蒸餾，并通過水洗萃取，得到反應后的催化劑，并將反應前后結構及形貌變化進行對比。

在碳酸鈉提供的堿性環境下，氨基酸中的氨根離子實現去質子過程，再與DMC 中的甲氧羰基進行親核反應后完成羰基化。然后，在乙酸鋅中Zn2+的作用下，發生分子內親核取代反應，脫去一分子CH3OH[17]，環化合成NCAs。兩步反應均可在“一鍋法”條件下進行，實現NCAs 合成[18]。

1.3 性能測試與結構表征

（1）氨基酸轉換率與NCAs 產率測定：采用LC-210 型高效液相色譜儀連接ELSD-2000 型蒸發光散射檢測儀組成高效液相色譜-蒸發光散射（HPLCELSD）檢測系統，以標準曲線法定量分析氨基酸的轉換率與NCAs 產率。液相測試條件為流動相100%HPLC-DMF，流量0.6 L/min；蒸發光散射測試條件為噴嘴溫度100 ℃，N2流速3 L/min。

（2）氣相色譜-質譜聯用分析：采用SCION 456-TQ 型氣相色譜-質譜聯用分析系統。氣相測試條件為：N2流速0.5 L/min，進樣口溫度250 ℃，溫度以10 ℃/min 速率由50 ℃升至200 ℃保持5 min，再以同樣的升溫速率升至250 ℃，保持10 min。質譜測試條件為：離子化能量70 eV，離子源溫度200 ℃。

（3）傅里葉紅外變換表征：采用Nicolet Is 50 型傅里葉紅外光譜儀，將樣品于60 ℃烘干后，與KBr 以一定比例混合后研磨壓片進行測試，測試波數為500 ～4 500 cm-1。

（4）液體核磁共振波譜表征：采用AVANCE III HD 400 MHz 型液體核磁共振波譜儀。將產物溶解于氘代二甲亞砜，對其進行1HNMR 和13CNMR 檢測。

（5）X 射線光電子能譜表征：在室溫條件下采用NEXSA 型X 射線光電子能譜儀對樣品進行XPS 表征，測試步長為0.1 eV。

（6）X 射線衍射表征：采用D8 ADVANCE 型X-射線衍射分析系統。Cu-Kα 為輻射源，掃描角度為5°～80°，掃描速率為5°/min，工作電流為40 mA，電壓為40 kV。

2 結果與討論

2.1 α-氨基酸-N-環內酸酐的定性分析

2.1.1 氣相色譜-質譜聯用表征

圖2 所示為NCAs 的GC-MS 譜圖。其中，圖2（a）為氨基酸與DMC 反應后上清液的GC 譜圖；圖2（b）—圖2（d）為對應時間所得的質譜圖。

圖2 NCAs 的GC-MS 譜圖Fig.2 GC-MS spectrums of NCAs

由圖2 可知，Phe-NCA、H-Asp-Obzl-NCA、Cbz-Lys-NCA 的氣相峰分別出現在4.18、3.72、4.15 min，峰形與位移時間同標準樣品基本一致，其對應相對分子質量分別為191、249 與306。甲氧羰基化后的中間體相對分子質量分別對應223、281 與338。通過相對分子質量換算可發現，3 份反應液中，除NCAs 產物外，均存在未反應的氨基酸、未環化的中間體以及一定量的副產物，其結構式如圖3 所示。例如，圖2（b）中相對分子質量為179 的信號為氨基與DMC 分子上的CH3結合成的副產物：α-氨基酸-N-甲基化（圖3 中的A）。由圖2（c）和圖2（d）中可以看出，除去部分副產物外，中間體上羧基也出現可能被二次甲基化的現象，出現甲氧羰基氨基甲酸酯的副產物（圖3 中的B）。由于NCAs穩定性較差，還可能脫去一分子CO2，失去相對分子質量為44 的分子碎片。

圖3 副產物的結構式Fig.3 Structural formula for by-products

2.1.2 傅里葉紅外變換表征

圖4 為NCAs 的FT-IR 譜圖。3 種氨基酸的氨基脫去質子，與DMC 中的酰基結合成酰胺鍵，在催化劑的作用下轉變為NCAs。

圖4 NCAs 的紅外表征Fig.4 FT-IR spectra of NCAs

由圖4 Phe-NCA 的紅外譜圖中可以看出，在3 252 和3 495 cm-1處出現的是環內酰胺的特征吸收峰，在1 729 和1 855 cm-1附近，分別為環狀酸酐中2個C—O 的伸縮振動峰，推斷產物為環狀酸酐。由Cbz-Lys-NCA 和H-Asp-Obzl-NCA 的圖譜可更清晰地觀察到1 300～1 200 cm-1間環狀酸酐中C—O 鍵的伸縮振動峰，而1 340～1 300 cm-1處表現為酰胺的Ⅲ譜帶，1 560～1 640 cm-1為N—H 的彎曲振動。由此證明DMC 法成功地制備出了3 種NCAs。

2.1.3 液體核磁共振波譜表征

圖5 為NCAs 的核磁譜圖。

圖5 NCAs 的核磁氫譜圖和核磁碳譜圖Fig.51H NMR and 13C NMR spectra of NCAs

由圖5 中的核磁氫譜圖可知：化學位移δ=2.49處為溶劑氘代二甲亞砜所屬信號。氨基酸酸酐環上的氨基質子的信號出現在化學位移δ=8.0 處。由于HAsp-Obzl-NCA 中COOC2H5的吸電子共軛作用，導致其略微向低場移動，并在δ=8.19 處出峰。Cbz-Lys-NCA 中酸酐環中和碳鏈上的亞甲基質子信號也在一定程度向低場移動，分別在5.10、3.61、3.01、2.91 和2.74處出峰，這是由—NH2強吸電子誘導所引起的。NCAs的其余官能團的化學位移均與其標準核磁氫譜相吻合。對比圖5 中核磁碳譜圖可以發現，酸酐環中O—C—O—C—O 的化學位移出現在譜圖中的167.0 和157.5 處，這進一步證明了NCAs 的成功合成。

2.2 反應條件的考察

2.2.1 去質子堿及乙酸鋅用量對反應的影響

去質子堿與催化劑的用量比對氨基酸轉化率（C）以及NCAs 產率（Y）的影響如表1 所示。

表1 去質子堿及乙酸鋅用量對反應的影響Tab.1 Effects of dosage of deprotic alkali and zinc acetate on reaction

由表1 可知，當反應體系中不加入Na2CO3時，氨基酸轉化率只有10%左右。這是由于常溫下氨基酸一般以氨基奪取羧基質子、氨基帶正電、羧基帶負電的兩性離子形式存在，不易發生反應。通過去質子化才能使氨基酸與DMC 反應，實現氨基酸的轉換。不同于強堿試劑，Na2CO3作為弱堿，能在不改變氨基酸活性的情況下，中和氨基上的質子，使氨基酸進入反應活化狀態。同時利用Na+與羧基相連，一定程度可以阻止DMC 上的活性基團與其相連。表1 中數據證明，當氨基酸與去質子堿的摩爾比為1 ∶1.5 時，3 種氨基酸的轉化率均在80%左右，繼續增加Na2CO3的比例，轉化率變化不大。由表1 可以看出，當反應體系中不添加乙酸鋅催化劑時，NCAs 的選擇性降低，使得產率下降，Phe-NCA 在不添加乙酸鋅的情況下，產率僅為7.88%。當氨基酸與催化劑的摩爾比為1 ∶0.2 時，NCAs選擇性最高，Phe-NCA、H-Asp-Obzl-NCA 和Cbz-Lys-NCA 的產率分別為55.22%、56.30%、46.46%，繼續增加乙酸鋅用量，產率沒有明顯增加，意義不大。綜上可知，反應中氨基酸∶去質子堿∶催化劑的摩爾比為1 ∶1.5 ∶0.2 最為合適。

2.2.2 反應溫度對催化反應的影響

反應過程中氨基酸的溶解度、中間體的成環及裂解均與反應溫度有著密切的聯系。以20 ℃為梯度，研究溫度對NCAs 的產率與選擇性的影響，結果如圖6 所示。

圖6 溫度對NCAs 產率與氨基酸轉換率的影響Fig.6 Effect of temperature on conversion rate and yield of NCAs

由圖6 可知，由于氨基酸結構差異，不同NCAs 的最適宜反應溫度有所差異。Phe-NCA 在160 ℃時轉換率最高，為80.58%，能達到最高產率55.22%。H-Asp-Obzl-NCA 在120 ℃時轉化率可以達到81.36%，產率為56.30%。Cbz-Lys-NCA 最佳反應溫度為140 ℃，轉化率為78.27%，能達到最高產率46.46%。隨著溫度的提升，氨基酸在DMF 中的溶解度增大，參與反應的原料增加，產率和選擇性逐漸變大。3 種氨基酸中Phe 的溶解溫度相對較高，因此，最佳反應溫度也相應增高。超過反應的最佳溫度后，NCAs 開始出現開環聚合，同時DMC 中也存在甲基化活性位點，導致氨基酸容易出現甲基化反應，因此，隨著溫度提高，H-Asp-Obzl-NCA 和Cbz-Lys-NCA 的產率出現先增后減的趨勢。

2.2.3 反應物間比例對催化反應的影響

反應物間摩爾比對NCAs 產率與氨基酸轉換率的影響如圖7 所示。

圖7 反應物間摩爾比對NCAs 產率與氨基酸轉換率的影響Fig.7 Effect of molar ratio between reactants on conversion rate and yield of NCAs

氨基酸與DMC 間的摩爾比也是影響NCAs 產率的關鍵因素。由圖7 可知，由于DMC 的沸點較低，而反應最佳溫度均在120 ℃以上，即便在冷凝回流的條件下DMC 也無法全部活化參與反應，因此，增加體系中DMC 的含量時，更多的C—O 鍵的氧與羰基碳形成共軛的平面結構[19]，與乙酸鋅上的Zn2+結合后，對氨基酸進行甲氧羰基化反應，導致氨基酸轉化率升高；同時由于Zn2+的強吸電子能力，使得氨基酸上的—COO—與羰基碳結合，實現環化，故NCAs 的產率明顯提升。當氨基酸與DMC 的摩爾比達到1 ∶40 時，NCAs 產率逐漸穩定。

2.3 催化劑作用分析

為了證實催化劑乙酸鋅在反應過程中發揮的作用，對反應前后的乙酸鋅進行表征。

2.3.1 SEM 表征

乙酸鋅作為均相催化劑，需減壓蒸餾并萃取后加入沉淀劑分離。圖8 為催化劑反應前后的SEM 對比圖。

圖8 Zn（OAc）2 反應前與反應后的掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of Zn（OAc）2 before and after reaction

由圖8 可見，未參與反應的乙酸鋅為不規則片層狀結構；反應結束后，乙酸鋅的片層結構消失，回收的催化劑尺寸變大且表面變得光滑。這是由于分離催化劑過程中乙酸鋅團聚以及溶劑殘留所導致的。

2.3.2 XPS 表征

為了進一步證實催化劑在反應過程中發揮的作用，對反應前后Zn（OAc）2中的Zn 和O 元素進行了光電子能譜測試，結果如圖9 所示。

圖9 Zn（OAc）2 反應前和反應后的X 射線光電子能譜分析Fig.9 X-ray photoelectron spectroscopy of Zn（OAc）2 before and after reaction

由圖9 中Zn2p 反應前后的分峰圖可以看出，Zn2p3/2的結合能由1 021.9 eV 增加至1 025.7 eV。這是由于乙酸鋅中原本親電的Zn2+進攻羰基上富電子的氧[20]，與DMC 中的羰基氧進行配位絡合為Zn—O[21]鍵后，其周邊的電子密度有所下降。反應過程中，去質子后的氨基作為親核試劑[22]，進攻DMC 上的羰基碳原子發生甲氧基羰基化反應，導致乙酸鋅和DMC 配合物中的配位鍵Zn—O 斷裂。然后乙酸鋅中的Zn2+再與氨基甲酸酯中的C—O 配位，使氨基甲酸酯中的羰基親電性增強，進而使得COONa 或COOH 中的O 容易進攻氨基甲酸酯中的羰基，實現精準環化。O1s 分峰圖在528～535 eV有ZnO 的特征峰，證明反應過程中乙酸鋅部分水解。

2.3.3 FT-IR 表征

乙酸鋅反應前后的FT-IR 譜圖如圖10 所示。

圖10 催化劑反應前后的FT-IR 譜圖Fig.10 FT-IR spectra of catalyst before and after reaction

由圖9 可知，參與反應前的乙酸鋅的FT-IR 譜圖在1 465 和1 565 cm-1處有峰，其分別為乙酸根離子的對稱伸縮峰與不對稱伸縮峰，而反應后的催化劑則在1 437 和1 600 cm-1處出峰。對比反應前后，會發現兩峰的間距明顯變大。這是由于Zn2+與DMC 結合后使得乙酸鋅由雙齒配合物轉變為單齒配合物所導致的[19]。同時，反應后的催化劑在524 cm-1處出現了Zn—O 的伸縮振動峰，也說明催化劑部分失活。在614 和706 cm-1處的峰則為催化劑表面殘留的中間體中酰胺的Ⅴ和Ⅳ譜帶，進一步說明乙酸鋅參與了反應，催化氨基酸實現甲氧羰基化過程。

2.3.4 XRD 表征

將反應前后的催化劑進行XRD 表征，結果如圖11 所示。

圖11 反應前和反應后Zn（OAc）2 的X 射線衍射圖Fig.11 XRD pattern of Zn（OAc）2 before and after reaction

由圖11 可以看出，反應后的乙酸鋅在11.79°、19.49°、25.73°處的衍射峰減弱，但在30°～70°范圍內出現了新的衍射峰，該衍射峰歸屬于ZnO 的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（112）等晶面衍射（標準卡JCPDS No.01-0089），證明乙酸鋅在反應過程中或回收過程中發生了水解。乙酸鋅水解是造成NCAs 產率下降的主要因素，開發合成一種非均相且有效大幅度提升酸酐產率的催化劑將是后續進一步探討的課題。

綜上所述，推測催化劑乙酸鋅在反應過程中的作用機理為：Zn2+與DMC 中的羰基氧進行配位絡合為Zn—O 鍵，使得電子云偏離羰基碳，更易與氨基反應得到氨基甲酸酯。氨基甲酸酯中的羰基更容易與Zn2+配位，從而增強了氨基甲酸酯中羰基的親核能力，并促進鄰近COO-與羰基碳發生親核取代，環化生成NCAs。

3 結 論

以氨基酸為原料、乙酸鋅為催化劑、DMC 為環化劑，通過“一鍋法”高效環保地合成了Phe-NCA、HAsp-Obzl-NCA 和Cbz-Lys-NCA 3 種新型NCAs。研究結果表明：

（1）在乙酸鋅的催化下，采用“一鍋法”成功合成了3 種新型α-氨基酸-N-環內酸酐（Phe-NCA、HAsp-Obzl-NCA、Cbz-Lys-NCA）。

（2）在體系中氨基酸∶去質子堿∶催化劑的摩爾比為1 ∶1.5 ∶0.2、氨基酸與DMC 摩爾比為1 ∶40 的條件下，反應進行8 h，Phe-NCA 在160 ℃下產率可達到55.22%。H-Asp-Obzl-NCA 在120 ℃下達到最佳產率56.30%，Cbz-Lys-NCA 在140 ℃的產率為46.46%。

（3）乙酸鋅與DMC 的配位絡合現象和電子密度偏差，促進DMC 上的甲氧羰基的轉移和中間產物發生親核取代，從而完成環化得到NCAs。