伊犁河谷豬瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒污染情況調查

王傳鋒 米青婕 皮志媛

（伊犁職業技術學院，新疆伊寧 835000）

豬瘟的防控主要依靠疫苗免疫，但豬瘟疫苗在臨床使用過程中常常出現免疫失敗的現象。研究表明，這與外源病毒的干擾有關，其中BVDV 的干擾是豬瘟疫苗免疫失敗的重要原因之一。BVDV 自然感染豬會出現類似豬瘟的臨床癥狀，主要包括仔豬生長發育不良、僵豬、貧血、結膜炎和腹瀉等。豬感染BVDV 后表現出的具體臨床癥狀和病理變化也不盡相同，如仔豬先天性感染BVDV 可產生抗體，也可發展為持續性感染，并在感染后數天內死亡；母豬自然感染BVDV 后可出現受孕率降低、流產和產死胎等現象；肥豬感染BVDV 后主要以慢性胃腸炎和敗血癥為特征，類似于慢性豬瘟。BVDV 廣泛存在于胎牛血清中，豬瘟疫苗的研制不可或缺的要使用胎牛血清，若使用了被BVDV 污染的胎牛血清，則該病毒會大幅降低豬瘟疫苗的免疫質量，導致豬瘟疫苗免疫失敗。因此，檢測胎牛血清和豬瘟疫苗中是否存在BVDV污染意義重大。本文采用實時熒光定量（RT-PCR）方法對伊犁河谷市售豬瘟疫苗和胎牛血清進行BVDV 檢測，以期為養豬企業選擇豬瘟疫苗提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNA 提取試劑盒和熒光定量PCR 試劑均購自大連寶生物公司；CFX96 熒光定量PCR 儀購自美國BIO-RAD 公司。低溫高速冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司。渦旋振蕩器購自深圳市科力易翔儀器設備有限公司；恒溫水浴鍋購自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 豬瘟疫苗和胎牛血清

新疆伊犁河谷地區市面所售的來自不同廠家的豬瘟疫苗和胎牛血清，具體信息見表1。

表1 待檢生物制劑樣品信息

1.3 引物合成

參照陳其兵等[1]合成引物及探針的方法，設計熒光定量所需引物及探針，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

上游引物PF 5’-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGT GG-3’

下游引物PR 5’-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3’

熒光探針PB 5’FAM-AGATGCCACGTGGACGAG GGC-BHQ1 3’

1.4 RNA 的提取

取稀釋后的豬瘟疫苗250 μL 加入750 μL Trizol，振蕩混勻后室溫放置5 min，再加入氯仿溶液250 μL，充分振蕩混勻后室溫放置10 min，4℃12 000 rpm 離心15 min，取500 μL 上清液，加入等量的異丙醇溶液混勻，靜置30 min 后，4℃12 000 rpm 離心10 min，棄去上清，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀物，4℃12 000 rpm 離心5 min 棄去上清，將離心管在室溫下靜置干燥20 min，然后加入30 μL ddH20，充分溶解后-20℃保存備用。

1.5 熒光定量RT-PCR

反應體系為：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL，10 μM TaqMan 探針0.4 μL，10 μM 上游引物0.4 μL，10 μM 下游引物0.4 μL、TaKaRa ExTaq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板2 μL。

反應條件為: 42℃5 min，95℃10 s；95℃5 s，60℃40 s（收集熒光FAM，40 個循環）。

2 結果與分析

對來自伊犁河谷地區市場上銷售的11 份豬瘟疫苗和12 份胎牛血清進行BVDV 實時熒光定量RT-PCR 檢測。結果顯示，豬瘟疫苗中共檢出2 份BVDV 陽性樣品，陽性率為18.2%，陽性樣本均為細胞源豬瘟疫苗，分別來自于國內疫苗生產廠家B 和E。胎牛血清檢出1份BVDV 陽性樣品，陽性率為8.3%，陽性樣本為H 生產廠家H-1 批號樣品，具體見表2。

表2 伊犁河谷地區市售生物制劑樣品中BVDV 感染情況檢測結果

3 討論

3.1 BVDV 感染對豬瘟疫苗的免疫干擾

在國內豬瘟弱毒疫苗中，時常有豬瘟疫苗被外源病原污染的報道，且污染源常為牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和支原體[2]。牛病毒性腹瀉病毒自首次被報道以來，在全世界很多畜牧業發達國家中流行[3]，如澳大利亞、德國等國家的豬群中BVDV 抗體陽性率達3%～40%，荷蘭達15%～20%。各種年齡的牛都可感染牛病毒性腹瀉病毒，以幼齡牛易感性最高，在垂直傳播后，會產生病毒血癥[4]。

受BVDV 感染的豬瘟疫苗，往往會導致豬瘟免疫失敗。主要原因是BVDV 可以對豬瘟疫苗的免疫產生干擾，不僅能抑制豬瘟抗體的產生，而且還可以刺激豬體產生大量的BVDV 抗體。因此，在生產過程中豬場內豬瘟抗體明明很高，但卻依然時有豬瘟的發生，究其原因是在檢測的抗體中，豬瘟保護抗體很少，大部分可能為BVDV 抗體[5]。

3.2 BVDV 存在于胎牛血清中造成豬瘟弱毒疫苗的污染

目前，我國規?；鲋信２《拘愿篂a病毒的感染率很高，很多地方對該病還未引起足夠重視。陶潔等[6]于2017—2020 年間對上海不同區豬場的血液樣品，利用多重RT-PCR 方法進行BVDV 檢測與分析。結果表明，上海地區豬群BVDV 的總體檢出率為7.14%，且呈現逐年遞增的趨勢。筆者曾調查過伊犁地區規?；鯞VDV 的感染率，個別牛場的感染率高達90%以上。胎牛血清是細胞培養的重要原料，以含BVDV 的血清作為原料時，就會污染所制備的生物制品[7]，如豬瘟細胞苗生產過程中會使用到牛睪丸細胞及胎牛血清，在豬繁殖與呼吸綜合癥（藍耳?。┮呙缟a工藝的傳代細胞培養中也會使用到胎牛血清，如果胎牛血清中含有BVDV 病原或抗體，會使豬瘟細胞苗和豬藍耳病疫苗遭到污染[8]。溫樹波等[9]從進口胎牛血清中成功分離到1 株非致細胞病變型BVDV 1b 亞型毒株。李艷萍等[10]從商品化的胎牛血清中分離到1 株致細胞病變（CP） 型BVDV（GS2018 株）。張超等[11]從進口胎牛血清中分離出1 株BVDV-2 型非致細胞病變毒株，從脫脂奶粉中檢測到BVDV 抗體，表明進口胎牛血清和脫脂奶粉中都存在BVDV 抗原和抗體污染。鞠厚斌[12]等對國內市售的胎牛血清進行熒光RT-PCR 檢測牛病毒性腹瀉病毒。結果顯示，胎牛血清BVDV 核酸陽性率為50%。劉陽等[13]研究發現豬瘟脾淋苗與細胞苗都能刺激機體產生免疫應答，無論是標準劑量還是加大劑量，細胞苗的免疫效果都優于脾淋苗。

細胞苗的廣泛使用，一定程度上增加了豬瘟疫苗被BVDV 污染的風險。這給疫苗的使用和推廣帶來了很多潛在的風險，使用無BVDV 污染并且無BVDV 抗體的牛供應細胞和血清是生產高安全性豬瘟疫苗的關鍵。加強對疫苗等生物制劑的制作工序及生產原料的監管，是企業和政府職能部門當務之急的重要工作，應當引起足夠的重視。

3.3 改善弱毒疫苗生產工藝，有效防范外源性感染

改進弱毒疫苗等生物制劑的生產工藝，也是當前破解疫苗中BVDV 污染現狀的一個有效途徑。目前，有疫苗生產企業在使用放射性鈷-60 對血清等進行輻射操作，以期殺滅血清中的BVDV；也有一些生物制劑廠家在研究無血清的細胞培養基，避免因原料污染而導致疫苗出現問題；還有企業在研究胎牛血清替代品，如馬血清等。

3.4 分子生物學方法能有效檢測BVDV

建立特異性強、準確率高的檢測方法是篩查豬瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒污染的關鍵。于新友等[14]建立的雙重熒光PCR 方法靈敏度高、特異性強、精密性好，可用于豬用疫苗中外源病毒的快速檢測及豬用疫苗等生物制品的質量控制。本文利用已成熟的BVDV實時熒光定量RT-PCR 方法對樣品進行檢測，對檢測出的陽性樣品送第三方檢測機構復檢，結果相似度100%。檢測結果表明，伊犁河谷市售的豬瘟疫苗和胎牛血清存在BVDV 的污染，這為伊犁河谷市規?；i場選擇安全性高的生物疫苗提供了依據。但同時疫苗中RT-PCR 檢測BVDV 也存在一定問題，若疫苗中存在滅活的少量BVDV 也能被檢測到，因此，檢測到的病毒有可能是滅活的BVDV。如何在有限的時間內區分BVDV 的活性，是值得學者研究的方向。

4 小結

目前，新疆部分地區大型規模養豬場豬瘟抗體合格率普遍高于中、小型規模養豬場，說明大型規模養豬場在豬瘟的防控方面具有一定優勢[15]，中小規模豬場還存在一定的豬瘟野毒感染風險。伊犁地區的生豬存欄量較大，且以中小型規模豬場為主，每年豬用疫苗的使用量相當大，這也使很多疫苗生產廠家為了搶占伊犁生豬市場，打價格戰造成疫苗質量得不到保障。伊犁河谷市所售的豬瘟疫苗種類繁多，豬場使用疫苗后，生豬時常出現類似豬瘟的臨床表現，這也提示養殖企業要加強對豬源BVDV 的檢測，為伊犁地區生豬產業的健康發展提供保障。