超聲協同酶法提取紅菇多糖工藝優化及不同產地紅菇多糖分析

鐘碧萍,吳曉青

((福建生物工程職業技術學院,福建 福州 350002))

紅菇(Russula)被譽為“中國純自然高級野生山珍”之一[1],在我國多個省市均有分布,較多出現在福建、云南、遼寧、江蘇、江西、廣東、廣西、四川等地[2],它不僅僅是一類珍稀的野生菌類,還富含蛋白質、氨基酸、多糖和其他人類健康所必需的營養素物質[3],紅菇多糖是紅菇中重要的成分之一,不同產地紅菇中多糖成分有所差異,但都具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗肝功能衰退[6]、降血壓、降血脂[7]等方面的藥理作用。

目前文獻報道的紅菇多糖提取方法主要有熱水提取[8-9]、微波輔助提取[10-11]、超聲輔助提取[12-13]等方法。熱水提取法環保、經濟安全,需要儀器簡單,但有耗時長,容易得到酸性多糖的缺點;微波提取法耗時短、節能,但容易產生局部高溫導致多糖結構發生改變;單獨的超聲波輔助提取法效率高、耗時短,但有效范圍較小,現有的三種紅菇提取方法各有優缺點。而超聲波協同酶法可兼具兩種提取方法的優點,與這幾種方法相比,具有提取效率高、耗時少、操作簡單等優點。

近年來,超聲波-酶解法已經成為植物多糖提取的重要手段,梁樂欣等[14]使用超聲波協同纖維素酶法提取紫蘇葉多糖;孫燕麗等[15]使用超聲波-復合酶法協同提取馬齒莧多糖;秦令祥等[16]使用超聲波協同復合酶法提取香菇多糖。然而,紅菇多糖的提取技術尚未得到充分的研究,目前還沒有用超聲波-酶法提取紅菇多糖的相關文獻,因此,本文將探索采用超聲波-纖維素酶法來提取紅菇多糖以及對不同產地的紅菇多糖含量差異進行分析,旨在為紅菇多糖提取提供新研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅菇:產自福建省三明市、云南省、廣東省,均為市售干貨;纖維素酶(50 000 U/g)購自上海阿拉丁化學試劑公司;葡萄糖、硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、氯仿、正丁醇等均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

UV-1810型紫外可見光分光光度計(購自上海市美普達儀器設備服務公司)、AL204型電子天平儀器(購自浙江省永康市金穗機械制造廠)、KQ-500B型超聲清洗器(購自昆山市超聲儀器服務公司)、HH-2S數顯恒溫式水浴鍋(購自常州市國旺儀器設備服務公司)、電熱鼓風恒溫式風干箱(購自上海市東星建筑實驗機械設備服務公司)、TG16-WS型離心機(購自長沙湘智離心機儀器設備服務公司)、SHD-Ⅲ循環水式多用真空泵(購自保定高新區陽光科教儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標曲制備

稱取無水葡萄糖0.15 g,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得1.5 mg/mL葡萄糖標準溶液。分別移取標準溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL置于100 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻。分別吸取系列濃度溶液1.0 mL再加入新配制的5%的苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸4.0 mL,混勻,沸水浴30 min,冷卻。在490 nm波長處測定吸光度,而后繪制標準曲線,用于紅菇多糖測定。

1.3.2 紅菇多糖制備

將野生紅菇烘干至恒重后用粉碎機粉碎,用密封袋分裝后放入干燥箱中備用。精密稱取0.25 g,根據實驗設計的液料比、超聲時間、超聲功率、酶解時間和酶解溫度提取多糖,過濾后,再將其和Sevage溶劑(氯仿和正丁醇的體積配比為4∶1)以體積比 5 ∶ 1 加以混勻,除去蛋白質[17]。分離有機相和水相,水相使用旋轉蒸發儀將其加以濃縮,然后將其與3倍體積量的無水乙醇混勻,抽濾,沉淀用丙酮經過3遍清洗,抽濾干燥,最終得到紅菇多糖的粗品。

1.3.3 多糖含量計算

采用苯酚-硫酸法[18]測定紅菇多糖含量,將按照1.3.2所述方法操作得到的粗多糖,溶解定容至500 mL,搖勻。取1.0 mL加入新配制的5%的苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸4.0 mL,混勻,沸水浴30 min,冷卻,在490 nm波長處測定吸光度,測定紅菇多糖含量,參考文獻[19]計算多糖質量。多糖得率=多糖質量/原料取樣質量。

1.3.4 單因素試驗設計

1.3.4.1 液料比試驗

選取20,30,40,50,60 mL/g五種濃度的液料比,在超聲時間40 min、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.2 超聲時間試驗

選取30,40,50,60,70 min五種不同超聲時間,在液料比30 mL/g、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.3 超聲功率試驗

選取100,150,200,250,300 W五種超聲功率,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.4 酶解時間試驗

選取20,30,40,50,60 min五種酶解時間,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解溫度40 ℃時,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.4.5 酶解溫度試驗

選取30,35,40,45,50 ℃五種酶解溫度,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解時間30 min時,用苯酚-硫酸法測定吸光度,得到紅菇多糖提取率。

1.3.5 正交試驗

根據單因素實驗結果,將超聲功率定為200 W,選擇液料比(A)、超聲時間(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)四個因素作為變量,將紅菇多糖的提取百分率為響應值,進行了四因素三水平正交測定,見表1。

表1 正交設計因素與水平表

1.3.6 驗證試驗

以選定的四因素三水平正交實驗確定出的最優提取條件進行驗證實驗,測出紅菇多糖提取率,驗證方法可靠性。

1.3.7 不同產地野生紅菇多糖含量測定

以正交試驗確定的最優提取條件測定福建三明、云南、廣東三種產地紅菇多糖的提取率,比較不同產地紅菇多糖含量差異性。

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

選取20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1(mL∶g)五種液料比,在超聲時間40 min、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定三種不同產地紅菇多糖提取得率(圖1)。結果顯示,液料比為40∶1(mL∶g)時多糖得率最高,原因可能是足夠的溶劑量是多糖溶出的必要條件,而當液料比達到一定時,多糖溶出率基本飽和,提取率趨于平穩,故不再繼續增加[20]。因此液料比40∶1(mL∶g)為最佳提取料液比,選擇液料比 30∶1,40∶1,50∶1(mL∶g)進行正交實驗。

圖1 液料比對多糖得率的影響

2.1.2 超聲時間對多糖得率的影響

選取30,40,50,60,70 min五種不同超聲時間,在液料比30 mL/g、超聲功率150 W、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定提取多糖得率(圖2)。結果顯示,超聲時間50 min時多糖得率最高,隨著超聲時間繼續增加,多糖提取率反而下降,原因可能是超聲時間超過一定時,會破壞多糖的分子結構,故而多糖提取率降低[21]。因此超聲時間選取50 min為最佳超聲時間,選擇超聲時間40,50,60 min進行正交實驗。

圖2 超聲時間對多糖得率的影響

2.1.3 超聲功率對多糖得率的影響

選取100,150,200,250,300 W五種超聲功率,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、酶解時間30 min、酶解溫度40 ℃時,測定多糖得率(圖3)。結果顯示,超聲功率200 W時多糖得率最高,繼續增加超聲功率,提取率反而下降,超聲功率不宜太大原因是功率太大,會破壞多糖分子的結構[22]。因此超聲功率選取200 W為最佳超聲功率。在正交試驗中選取200 W超聲功率用于紅菇多糖提取。

圖3 超聲功率對多糖得率的影響

2.1.4 酶解時間對多糖得率的影響

選取20,30,40,50,60 min五種酶解時間,在液料比30 mL/g、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解溫度40 ℃時,測定紅菇多糖提取得率(圖4)。結果顯示,酶解時間30 min時,多糖得率最高,繼續增加酶解時間,得率不再增加,原因是超過30 min時,多糖提取已經較為完全,得到的多糖會出現分解,因此酶解時間選取30 min為最佳酶解時間,選擇酶解時間 20,30,40 min進行正交實驗。

圖4 酶解時間對多糖得率的影響

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響

選取30,35,40,45,50 ℃五種酶解溫度,在液料比30∶1(mL∶g)、超聲時間40 min、超聲功率150 W,酶解時間30 min時,測定紅菇多糖得率(圖5)。結果顯示,酶解溫度35 ℃時,紅菇多糖得率最高,溫度超過35 ℃,多糖提取得率反而有所下降,原因是溫度太高,會導致多糖的降解,因此酶解溫度選取35 ℃為最佳酶解溫度,選擇酶解溫度 30,35,40 ℃進行正交實驗。

圖5 酶解溫度對多糖得率的影響

2.2 正交試驗結果與分析

進行四個不同的因素的三水平正交試驗,將液料比(A)、超聲時間(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)作為四個重要的參數,液料比選擇30∶1,40∶1,50∶1(mL∶g),超聲時間選擇40,50,60 min,酶解時間選擇20,30,40 min,酶解溫度選擇30,35,40 ℃,將紅菇多糖的提取率(%)作為評估的指標,實驗結果見表2。

表2 正交試驗結果與分析表

由表2可知,四個因素對紅菇多糖的提取率均有影響,比較極差R可以看出,料液比(A)對多糖提取率的影響最大,而后依次為酶解時間、超聲時間、酶解溫度。采用A2B2C2D2作為提取紅菇多糖的最佳參數,即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃。

2.3 驗證性試驗

通過正交試驗得到最優條件下,即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃條件下做 3 次平行試驗,得到紅菇多糖提取率為8.753%。經過實驗,我們發現提取率與正交實驗最高提取率略高,說明了提取方法穩定可靠。

2.4 不同產地野生紅菇多糖含量測定

以正交試驗確定的最優提取條件,即液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃條件下做3次平行試驗,測定福建三明產地的紅菇多糖提取率為8.753%、云南產地的紅菇多糖提取率為7.953%、廣東產地的紅菇多糖的提取率為8.836%。從數據中可知,福建、廣東產地的紅菇多糖提取率差別并不顯著,而云南產地的多糖提取率與其余兩種產地相比多糖含量較低,原因可能與紅菇生長土壤、環境及天氣有關,文獻中得知,目前紅菇屬有300多種,國內有90多種[23],后續可研究其他產地種屬紅菇,以期發現多糖含量更高的種屬,文章所研究的三種產地紅菇均可作為多糖進一步開發利用的原料。

3 結論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗設計,得出超聲波-酶法協同提取紅菇多糖在液料比40∶1(mL∶g)、超聲時間50 min、酶解時間30 min、酶解溫度35 ℃時,可以獲得紅菇多糖的最優提取效果,福建三明產地的紅菇多糖提取率為8.753%、云南產地的紅菇多糖提取率為7.953%、廣東產地的紅菇多糖的提取率為8.836%。提取方法為超聲協同纖維素酶法,可以兼具兩種提取方法的優點,與現有文獻報道的紅菇多糖方法相比,試劑用量小、耗時短、生物活性強且提取率更高,故此方法可為后續紅菇多糖研究提供更多參考,為紅菇在保健與食品等方面的應用提供依據。