隔山消高效液相指紋圖譜研究及分析

朱丹,黃雨睿,羅文靜,麻秀萍

(貴州中醫藥大學 藥學院,貴州 貴陽 550025)

隔山消,又名飛來鶴(《植物名實圖考》)、耳葉牛皮消 (《中國藥用植物志》) 、隔山撬 (《分類草藥性》、白首烏 (江蘇、江西) ,牛皮凍 (湖南,四川) ,過山消 (廣西) ,羊角藤根 (貴州) 等[1];是蘿藦科植物耳葉牛皮消的干燥塊根[2]主要分布在我國的云南、貴州、四川等地的少數民族聚居區[3],為苗族、布依族、土家族的民族藥。隔山消化學成分復雜,主要有苯乙酮類[4-6]、C21-甾體苷類[7-8]、有機酸類,黃酮類、糖類[9-10]、生物堿類以及醛類等化學成分。具有改善胃腸道[11]、抗腫瘤[12-14]、抗氧化[5-6]等多種藥理作用。

目前,貴州省內有以隔山消藥材為主藥制成的中藥制劑用于臨床,且有顯著的療效,如貴州永樂藥業有限公司生產的“消痞和胃膠囊”,貴州飛云嶺藥業股份有限公司生產的“隔山消積顆?！?。中藥材的質量直接決定其療效,且不同地區的隔山消的化學成分含量差異較大,所以,有必要對隔山消藥材的質量控制進行研究,提高其質量標準,使中藥材和中藥制劑質量更加穩定,發揮更加穩定的臨床療效。

中藥指紋圖譜是指通過一定的分析手段,如HPLC、GC、LC-MC,得到的共有峰的譜圖,可用于評價中藥的真實性、穩定性和一致性,對提高中藥的質量,促進中藥現代化[15]。

基于此,本文擬用20批不同產地隔山消藥材作為研究對象,建立HPLC指紋圖譜,進一步地提高中藥材和中藥制劑質量的穩定性和可控性,保證中藥制劑的臨床療效,為更好地促進中藥材和中藥制劑的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Shimadzu Essentia LC-16(紫外-可見檢測器、二元梯度泵、島津液相色譜系統化學工作站、日本Shimadzu公司);Kinetex C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;KQ-300DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CN-LPC6002型電子天平(昆山利平計量設備有限公司);Microliter Syringes微量進樣器(25 μL,上海高鴿工貿有限公司);SHZ-D(III)型循環水真空泵(邦西儀器科技上海有限公司);抽濾裝置(2 000 mL天津市津騰實驗設備有限公司)。

乙腈為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司);甲醇為分析純(重慶川東化工有限公司);磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);實驗用水為重蒸餾水。隔山消樣品從各地中藥材市場購得,經粉碎后過50目(篩孔徑0.3 mm)篩備用,具體樣品信息見表1。

表1 20批隔山消樣品信息

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備

將隔山消藥材粉碎后過50目篩(篩孔徑0.3 mm),取過篩后藥材粉末1.5 g,精密稱定,置于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入70% 甲醇10 mL,密塞并稱重,超聲30 min,70% 甲醇補重,搖勻,過濾,續濾液用0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

1.2.2 色譜條件

色譜柱:Kinetex C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:流速1.0 mL·min-1;進樣體積:20 μL;檢測波長:210 nm;柱溫:常溫;0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫,具體洗脫程序見表2。

表2 0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 隔山消指紋圖譜的建立

將20批隔山消指紋圖譜導入中藥指紋圖譜相似度評價軟件(2012.130732版本)進行相似度評價計算,以S12為參照,對照圖譜生成方法為中位數,時間窗高度為0.1,經過多點校正,生產對照指紋圖譜和疊加指紋圖譜。與對照圖譜比較,各指紋圖譜的相似度在0.883～0.991之間,其中貴州畢節7月相似度為0.883,與對照圖譜比較相似度最低,可能由于產地、月份、氣候、制備工藝不同,而其他批次相似度均在0.9以上,一般情況下相似度在0.9～1.0符合要求,所以說明其他各批次間共有成分基本一致。相似度評價結果見圖1。

圖1 隔山消HPLC對照指紋圖譜

2.2 方法學驗證

2.2.1 精密度試驗

按“1.2.1”項的方法制備供試品溶液,按照“1.2.2”項下色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖。以S3為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值小于3%,表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗

按“1.2.1”項的方法制備6份供試品溶液,按照“1.2.2”項下色譜條件重復進樣6次,記錄色譜圖。以S3為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值小于3%,表明該方法重復性良好。

2.2.3 穩定性試驗

按“1.2.1”項的方法制備供試品溶液,室溫放置0,2,4,8,12,24 h時,按照“1.2.2”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。以S3為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值小于3%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3 相似度評價

將20批隔山消指紋圖譜導入中藥指紋圖譜相似度評價軟件(2012.130732版本)進行相似度評價計算,以S12為參照,對照圖譜生成方法為中位數,時間窗高度設定為0.1,經過多點校正,生產對照指紋圖譜和疊加指紋圖譜。與對照圖譜比較,各指紋圖譜的相似度在0.883～0.991之間,其中貴州畢節7月相似度為0.883,與對照圖譜比較相似度最低,可能由于產地、月份、氣候、制備工藝不同,而其他批次相似度均在0.9以上,一般情況下相似度在0.9～1.0符合要求,所以說明其他各批次間共有成分基本一致。相似度評價結果見表3。

表3 20批隔山消相似度評價結果

2.4 聚類分析(CA)

聚類分析是指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個類的分析過程,目標是在相似的基礎上收集數據來分類。

本論文采用 SPSS 26.0軟件,以20批隔山消中的23個共有峰的峰面積為變量,采用組內連接方法,平方歐式距離進行聚類分析,結果見圖2。結果顯示當平方歐式距離為 25 或20時,20批隔山消藥材可分為 2 類,S6、S10、S13、S14、S19 為一類,其余批次的隔山消藥材為另一類;當平方歐式距離為15時,20批隔山消藥材可分為3類,S6、S10、S13、S14、S19 為一類,S12單獨為一類,其余批次的隔山消藥材為另一類。這可能與藥材來源、產地、制備工藝、采摘季節等因素有關,導致批次之間隔山消藥材的質量有差異。

圖2 20批隔山消指紋圖譜共有峰聚類樹狀圖

2.5 主成分分析(PCA)

主成分分析是對復雜的多個變量進行降維,通過少數幾個代表性的成分反映原始數據的大部分信息[12],是原始變量的線性組合。

為綜合評價不同批次間隔山消藥材的質量差異,將20批樣品23個共有峰的峰面積作為原始數據,采用SPSS 26.0軟件進行主成分分析。以特征值>1為標準,共得到7個主成分,其特征值分別為10.064,2.727,2.336,1.932,1.418,1.198,1.011,對總方差的累積貢獻率為89.939%(>80%)。其中主成分1反映1,5,7,9,10,15,17,18,20～23號峰的信息;主成分2反映8,11,12,14,19號峰的信息;主成分3反映3,4,6號峰的信息;主成分4反映6,13號峰的信息;主成分5反映2號峰的信息;主成分6反映12號峰的信息;主成分7反映16號峰的信息。采用正交性旋轉法,得到23個共有峰在7個主成分的主成分載荷矩陣,見表4,根據主成分載荷矩陣,可算出主成分得分系數矩陣,見表5。

表4 主成分載荷矩陣

表5 主成分得分系數矩陣

根據主成分得分系數矩陣,可見23個變量對各主成分的正負相關。對比各共有峰,3號峰對不同批次的隔山消指紋圖差異的貢獻值較小,分離度好(大于1.5),且峰面積適中,作為指紋圖譜的參照峰合適,說明本實驗隔山消指紋圖譜所選取的參照峰合理。

根據表5,以Z1、Z2、Z3、Z4、Z6、Z7分別表示主成分1,2,3,4,5,6,7,Z代表7個主成分的綜合值,X1～X23分別代表23個共有峰峰面積的標準化數值,用于反映20批隔山消藥材所表征的信息,得到線性組合的表達式,所得表達式相加即得綜合評價函數,得到20批隔山消藥材的綜合得分,將其進行排序,結果如表6。

表6 樣本主成分得分及排名

Z值越大,表明隔山消藥材的綜合品質越高。結果顯示S19(貴州畢節),S12(四川廣安)和S13(貴州畢節)的綜合得分最高,質量相對較好,其次是S7(四川廣安),S8(四川廣元)。這可能與藥材來源、產地、制備工藝、采摘季節等因素有關,導致批次之間隔山消藥材的質量有差異。

主成分1,2,3的得分值(Z1 ～ Z3)建立其三維坐標體系的散點圖,見圖3。由此可知,S12較分散可單獨聚為一類,S6、S10、S13、S14、S19可聚為一類,其余批次的隔山消藥材聚為一類,結果與聚類分析一致。

圖3 20批隔山消主成分分析的三維散點圖

3 結論與討論

綜上所述,本實驗通過對20批隔山消藥材建立HPLC指紋圖譜,樣品的出峰數目、分離度較理想,符合指紋圖譜研究的技術要求。并結合中藥指紋圖譜結合化學模式識別手段應用最普遍的分析方法,即相似度分析、聚類分析、主成分分析對隔山消藥材進行評價[12],除貴州畢節的隔山消藥材相似度在0.9以下,其余批次均在0.9以上,聚類分析可分為三類,提取了7個主成分,得出貴州畢節(2022年4月)和四川廣安(2021年7月)的質量較好。本實驗對隔山消藥材的質量控制進行了補充,為隔山消的質量標準提高了數據支撐,可供隔山消中藥材和中藥制劑質量更加穩定,發揮更加穩定的臨床療效。