多算法熒光漲落超分辨顯微集成平臺(tái)

李文波， 邱 錦， 許必晴， 許燦華， 黃衍堂， 曾志平

（福州大學(xué)物理與信息工程學(xué)院，福州 350108）

0 引 言

熒光顯微成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及其功能的研究，然而細(xì)胞內(nèi)部的大多數(shù)細(xì)胞器尺寸遠(yuǎn)小于光學(xué)衍射極限，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)無法對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器相互作用進(jìn)行清晰成像和監(jiān)測(cè)。

為了觀察到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)部的運(yùn)作機(jī)理，研究人員發(fā)明出了多種超分辨光學(xué)顯微系統(tǒng)，如受激發(fā)射損耗超分辨顯微成像［1-2］、結(jié)構(gòu)光照明顯微成像［3］、單分子定位顯微成像［4］、基于熒光漲落的超分辨顯微成像等方法［5-7］。目前已有多種熒光漲落超分辨成像算法，如超分辨光學(xué)漲落成像算法［8-10］（Superresolution Optical Fluctuation Imaging，SOFI）、超分辨徑向漲落成像算法［11-12］（Super-Resolution Radial Fluctuations，SRRF）、多信號(hào)分類成像算法［13］（Multiple Signal Classification Algorithm，MUSICAL）、基于熵值分析的超分辨成像算法［14］（Entropy-based Super-resolution Imaging，ESI）等，這些算法在不同成像幀數(shù)、熒光漲落頻率等條件下能夠各自取得分辨率的顯著提升。

在熒光漲落超分辨成像的應(yīng)用中，目前缺乏一個(gè)能夠同時(shí)對(duì)熒光漲落圖像序列進(jìn)行多算法處理的集成系統(tǒng)平臺(tái)。對(duì)此，本文開發(fā)了多算法熒光漲落集成超分辨顯微成像軟件平臺(tái)，能夠?qū)晒鉂q落超分辨成像進(jìn)行多算法對(duì)比和超分辨圖像質(zhì)量評(píng)價(jià)及優(yōu)化。

1 基于熒光漲落的光學(xué)超分辨成像原理

（1）熒光漲落。在傳統(tǒng)的光學(xué)顯微成像中，樣本中每個(gè)發(fā)光點(diǎn)源在經(jīng)過成像系統(tǒng)被采集到時(shí)均擴(kuò)散成了一個(gè)艾里斑。隨著兩個(gè)點(diǎn)源距離的減小，艾里斑的疊加無法被有效分辨出來，如圖1 所示。這一現(xiàn)象限制了光學(xué)顯微成像系統(tǒng)分辨率的進(jìn)一步提高，對(duì)于可見光成像，該分辨率極限大概約在200 nm。通過熒光標(biāo)記技術(shù)與熒光漲落特性能夠突破光學(xué)衍射分辨率極限，免疫熒光標(biāo)記技術(shù)的原理是將熒光分子固定在抗體上再與細(xì)胞中相應(yīng)的抗原進(jìn)行結(jié)合，從而可以清楚觀察到對(duì)應(yīng)的蛋白分子，這是常用的觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法之一。用于細(xì)胞標(biāo)記的熒光分子在激發(fā)光的照射下，電子吸收能量從基態(tài)（S0）躍遷到激發(fā)態(tài)（S1），當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回落到基態(tài)時(shí)發(fā)出熒光，如圖2所示。對(duì)于量子點(diǎn)、有機(jī)熒光分子和部分熒光蛋白，激發(fā)的過程中，熒光信號(hào)發(fā)光強(qiáng)度并不是恒定不變的，會(huì)隨著時(shí)間產(chǎn)生隨機(jī)波動(dòng)，這一現(xiàn)象就是熒光隨機(jī)漲落現(xiàn)象，稱為熒光間歇性，如圖3 所示。量子點(diǎn)的熒光時(shí)間閃爍特性呈現(xiàn)出冪次定律的概率分布，這與系統(tǒng)噪聲的分布特征有著明顯的區(qū)別，且各個(gè)量子點(diǎn)之間的熒光漲落具有相互獨(dú)立性，為基于熒光漲落特性實(shí)現(xiàn)圖像空間分辨率和信噪比的提升提供理論上的可行性。

圖1 2個(gè)熒光光源下不同距離的熒光分布

圖2 Jablonski熒光發(fā)光原理

圖3 熒光漲落強(qiáng)度和背景噪聲強(qiáng)度隨時(shí)間變化示意

（2）SOFI 算法原理。基于熒光漲落的超分辨顯微技術(shù)能夠通過熒光分子的隨機(jī)漲落特性提升成像空間分辨率。SOFI算法［8］通過計(jì)算圖像序列的n 階累積量函數(shù)，將圖像序列的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)減小n 倍。寬場(chǎng)熒光顯微成像的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)近似于二維高斯分布，通過SOFI 分析能夠?qū)⑵浒敕迦珜挏p小倍，從而實(shí)現(xiàn)倍的空間分辨率提升。

（3）SRRF算法原理。SRRF［11］根據(jù)圖像序列中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的徑向?qū)ΨQ性，通過計(jì)算圖像梯度場(chǎng)分布的徑向度，以較高的精度確定熒光分子中心區(qū)域的位置。然后通過熒光顯微鏡采集多幀熒光漲落圖像序列，結(jié)合熒光分子的時(shí)間漲落特性提高成像的空間分辨率。

其他基于熒光漲落的超分辨顯微技術(shù)通過采用不同的數(shù)學(xué)函數(shù)進(jìn)行分析，比如MUSICAL［13］依賴于奇異值分解求解本征圖像，ESI［14］通過計(jì)算圖像序列的信息熵等函數(shù)分析，顯著提升熒光顯微成像的空間分辨率。

2 多算法重建圖像對(duì)比

2.1 多算法仿真與分析

2.1.1 熒光信號(hào)仿真

（1）仿真過程。熒光漲落信號(hào)的仿真過程如圖4所示，使用仿真亞細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)來模擬細(xì)胞中被標(biāo)記的蛋白，再將其與二維高斯函數(shù)卷積模擬點(diǎn)光源經(jīng)過光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)衍射后捕獲的圖像。

圖4 多算法熒光漲落超分辨顯微成像仿真過程

（2）超分辨算法重建參數(shù)。通過仿真獲得100 幀圖像序列，對(duì)其進(jìn)行SOFI、SRRF、ESI 和MUSICAL 處理，其結(jié)果如圖5 所示。SRRF 參數(shù)為插件默認(rèn)值。ESI則進(jìn)行2 次迭代：第1 次參數(shù)：output=10，Order=1。然后將生成的10 幀序列進(jìn)行第2 次迭代，第2 次參數(shù)：output=1，Order =1。MUSICAL 程序設(shè)置參數(shù)：Value=0，Alpha=10，frames=100。

圖5 熒光漲落仿真圖像及其超分辨算法處理結(jié)果 （a）圖像序列的寬場(chǎng)圖像，（b）寬場(chǎng)圖像局部放大圖，（c）二階SOFI重建圖像，（d）MUSICAL重建圖像，（e）SRRF重建圖像，（f）ESI重建圖像

2.1.2 仿真結(jié)果分析

使用分辨率縮放皮爾遜系數(shù)（Resolution-Scaled Pearson coefficient，RSP）［15］、分辨率縮放誤差（Resolution-Scaled Error，RSE）［15］、強(qiáng)度相對(duì)誤差K、信噪比SNR表征每種算法重建圖像的質(zhì)量，表達(dá)式分別為：

表1 不同超分辨算法下仿真圖像重建質(zhì)量對(duì)比

圖5 所示為熒光漲落仿真圖像及超分辨算法處理結(jié)果。圖6 所示為圖5 黃線x1處的歸一化強(qiáng)度曲線。由圖6 可知，4 種算法均在一定程度上提升了圖像的分辨率。從圖中曲線可看出寬場(chǎng)圖像無法顯示微管交叉處的結(jié)構(gòu)；二階SOFI與ESI僅能勉強(qiáng)顯示出2 個(gè)峰值；SRRF能夠有效分辨距離130 nm 的交叉結(jié)構(gòu)，但是其峰值處強(qiáng)度波動(dòng)明顯，說明重建圖像的均勻性較差，這與強(qiáng)度的K 表征結(jié)果一致；MUSICAL 重建圖像在微管結(jié)構(gòu)交叉處的分辨率得到明顯提升，能夠?qū)⒔徊娼Y(jié)構(gòu)處信號(hào)分離。但是交叉處的微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的形變，峰值坐標(biāo)產(chǎn)生了位移，這與RSE 所反應(yīng)結(jié)果相同，重建誤差最大。MUSICAL算法是采用小窗口逐個(gè)移動(dòng)實(shí)現(xiàn)超分辨算法，需要對(duì)每個(gè)小窗口進(jìn)行處理，其計(jì)算時(shí)長(zhǎng)遠(yuǎn)大于另外3 種算法。

圖6 寬場(chǎng)圖像以及4種超分辨算法重建圖像在仿真微管交叉點(diǎn)處的強(qiáng)度分布曲線

在仿真圖像中加入高斯噪聲模擬更加真實(shí)的信號(hào)采集條件，并通過均值偏移算法（Mean-Shift Super Resolution，MSSR）［16］對(duì)圖像序列進(jìn)行降噪預(yù)處理。MSSR算法通過計(jì)算平均偏移矢量的局部幅度峰值識(shí)別熒光和噪聲信號(hào)，并降低噪聲信號(hào)強(qiáng)度和優(yōu)化圖像分辨率，再使用SOFI、SRRF、ESI 超分辨算法重建，如圖7 所示。圖8 所示為圖7 中黃線x2處歸一化強(qiáng)度曲線。對(duì)比圖8 可見，經(jīng)過MSSR 算法預(yù)處理的3 種算法的重建圖像的背景噪聲強(qiáng)度比直接使用超分辨算法處理的強(qiáng)度低，與圖9 紅圈內(nèi)的結(jié)果相一致。與此同時(shí)，MSSR-SOFI 還進(jìn)一步提升了重建分辨率。

圖8 寬場(chǎng)圖像、MSSR-寬場(chǎng)、SOFI、MSSR-SOFI亞細(xì)胞微管交叉點(diǎn)處的強(qiáng)度分布曲線

圖9 熒光漲落實(shí)驗(yàn)圖像及4 種超分辨算法重建圖像結(jié)果（a）亞細(xì)胞微管蛋白寬場(chǎng)平均圖像，（b）為寬場(chǎng)圖像局部放大圖，（c）四階SOFI 及MSSR-SOFI 重建圖像，（d）MUSICAL 及MSSR-MUSICAL 重建圖像，（e）SRRF 及MSSR-SRRF重建圖像，（f）ESI及MSSR-ESI重建圖像

2.2 多算法實(shí)驗(yàn)與分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)過程

（1）實(shí)驗(yàn)步驟。①對(duì)細(xì)胞使用40 mL/L甲醛固定15 min，然后使用1 ×PBS（Phosphate Buffered Saline）磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3 次清洗；②使用3 mL/L Triton X-100 溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透方便染色，滲透后進(jìn)行3 次清洗；③使用50 mL/L羊血清蛋白的PBT溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉處理，消除抗體的非特異性結(jié)合；④使用一抗孵育細(xì)胞過夜，孵育結(jié)束使用1 ×PBS 清洗3 次；⑤使用對(duì)應(yīng)的二抗孵育細(xì)胞；⑥細(xì)胞封片，并使用熒光相機(jī)捕獲微管蛋白圖像序列。

（2）超分辨算法運(yùn)行參數(shù)。對(duì)圖像序列使用4 種超分辨算法處理，并對(duì)超分辨圖像進(jìn)行重建質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2 所示。ESI算法為2 次迭代，①output=5，Order=1；②output =1，Order =1。MUSICAL 程序參數(shù)Value= -0.3，Alpha=5，frames=100。SRRF程序參數(shù)：Ring Radius=0.7，其余為默認(rèn)值。

表2 不同超分辨算法下實(shí)驗(yàn)圖像重建質(zhì)量對(duì)比

2.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖9 所示為熒光漲落實(shí)驗(yàn)圖像及4 種超分辨算法重建結(jié)果。圖10 所示為圖9 中黃線x3處的歸一化強(qiáng)度分布。其中，圖9（a）為微管蛋白圖像序列求平均強(qiáng)度分布圖，截取寬場(chǎng)部分區(qū)域［見圖9（b）］，對(duì)圖像序列使用MSSR算法預(yù)處理提高信噪比再進(jìn)行超分辨算法處理，結(jié)果如圖9（c）～（f）白線上半部分所示，直接使用超分辨算法處理圖像序列，結(jié)果如圖10（f）白線下半部分所示。寬場(chǎng)圖像信號(hào)的分辨率較低，微管交叉位置無法有效分辨微管結(jié)構(gòu)。

圖10 寬場(chǎng)圖像及4種超分辨算法重建圖像在亞細(xì)胞微管交叉點(diǎn)處的強(qiáng)度分布曲線

（1）MUSICAL 重建結(jié)果分析。MUSICAL 獲得了比較好的重建效果，成功分離2 個(gè)微管在交叉處的信號(hào)。但是重建圖像K 值最高，微管結(jié)構(gòu)的均勻性較差，RSE誤差也最大。

（2）SRRF 重建結(jié)果分析。SRRF 重建結(jié)果能夠?qū)⑽⒐芙徊鎱^(qū)域很好地分離開，有效地提高了圖像分辨率。但是SRRF出現(xiàn)了使整個(gè)圖像結(jié)構(gòu)變窄和微管結(jié)構(gòu)不連續(xù)的情況。

（3）SOFI重建結(jié)果分析。SOFI 算法的重建圖像強(qiáng)度曲線結(jié)果僅能夠分離開2 個(gè)峰值分布，無法有效區(qū)分細(xì)胞微管的交叉結(jié)構(gòu)精細(xì)分布。因?yàn)樘幚淼膱D像只有100 幀，無法滿足4 階SOFI 所要求的幀數(shù)，使得部分熒光信號(hào)消失。

（4）ESI重建結(jié)果分析。經(jīng)過2 次迭代的ESI 算法能夠有效分開微管交叉區(qū)域，RSE誤差最低，同時(shí)2次迭代的過程中也消除背景噪聲，獲得了比較高的信噪比。ESI算法通過計(jì)算圖像序列的信息熵實(shí)現(xiàn)超分辨成像，像素接收到的信號(hào)越多，熒光波動(dòng)越大，熵值越高。因此，在圖9（f）右下角區(qū)域的高熒光信號(hào)密度區(qū)域出現(xiàn)了高亮現(xiàn)象，無法有效區(qū)分其中的信號(hào)。

對(duì)比圖9（c）～（f）白線上下兩部分可以明顯看出，使用MSSR算法預(yù)處理的重建圖像信噪比更高，不過圖像均勻性都出現(xiàn)了一定程度的下降，需根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用需求進(jìn)行選擇。

3 結(jié) 語

本文開發(fā)了多算法熒光漲落超分辨顯微集成平臺(tái)，能夠用于模擬生成隨機(jī)漲落的熒光信號(hào)，以及執(zhí)行4 種基于熒光隨機(jī)漲落的超分辨算法圖像重建。通過仿真生成一組熒光漲落信號(hào)序列以及實(shí)驗(yàn)制備一組微管蛋白熒光序列得到2 組圖像序列，并使用4 種基于熒光漲落的超分辨算法以及均值偏移算法對(duì)2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到超分辨算法重建圖像，結(jié)果表明：①4種超分辨算法均能提高熒光圖像的分辨率，實(shí)現(xiàn)倍左右空間分辨率提升；②使用MSSR進(jìn)行降噪預(yù)處理能夠有效提高重建圖像的信噪比。本文開發(fā)的超分辨顯微成像集成平臺(tái)能夠用于多算法亞細(xì)胞熒光超分辨成像研究、光學(xué)顯微成像教學(xué)演示以及物理光學(xué)科普展示等多方面應(yīng)用，為生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究提供高效的超分辨成像技術(shù)平臺(tái)。