生物科學專業開設卵母細胞體外成熟實驗

孫曉鳳， 李 蘭

（青島農業大學生命科學學院，山東青島 266109）

0 引 言

小鼠卵母細胞體外成熟是實驗胚胎學的重要內容。小鼠的卵母細胞從卵泡釋放之后，可以在體外自發成熟，且小鼠卵母細胞體外培養操作步驟簡單，所需時間較短，比較容易安排實驗，因此可以考慮在相關專業本科生尤其是生物科學專業細胞生物學或者發育生物學實驗課程中引入該實驗。小鼠卵母細胞體外成熟過程中生發泡期（Geminal Vesicle，GV），生發泡破裂期（GV Breakdown，GVBD）以及第1 極體排出各時期的特征清晰，示教效果非常好。對卵母細胞成熟過程的知識也在人類胚胎體外受精（IVF）和動物生產中具有重要的實際應用，本實驗的開設可以加深學生對減數分裂以及卵子發生的理論認識水平，提高學生對胚胎操作以及生物科學，生殖生物學的興趣。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與器材

（1）實驗儀器。體式顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，二氧化碳培養箱。

（2）實驗器材。3 cm直徑培養皿，口吸管。

1.2 實驗材料與試劑

（1）實驗材料。青春期雌性小鼠。

（2）實驗試劑。生理鹽水，米力農，M2 培養基，M16 培養基，青霉素，鏈霉素，熒光染料Hoechst33342。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵巢分離與卵母細胞收集

在M2 培養基中加入米力農（米力農工作濃度為2.5 μmol/L）配制撿卵洗卵緩沖液，M2 培養基成分如下：二水氯化鈣0.251 37 g/L，無水硫酸鎂0.164 9 g/L，氯化鉀0.356 35 g/L，磷酸氫鉀0.162 g/L，碳酸氫鈉0.35 g/L，氯化鈉5.531 93 g/L，牛白蛋白4.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，HEPES 5.427 26 g/L，丙酮酸鈉0.036 3 g/L，乳酸鈉2.95 g/L，酚紅0.010 6 g/L。成熟培養之前的所有操作步驟均在撿卵洗卵緩沖液中進行。利用頸椎脫臼法將青春期雌性小鼠處死，取出小鼠卵巢，剝離周圍其他組織，去掉最外層的致密膜，用添加了青霉素、鏈霉素的生理鹽水清洗3 次后將卵巢轉移到撿卵洗卵緩沖液中，用注射器針頭進行機械穿刺后不斷擠壓，徹底釋放卵母細胞，之后用移液器輕輕吹打，在顯微鏡下觀察到卵母細胞周圍沒有粘附的顆粒細胞即可。在體式顯微鏡下用口吸管取出卵母細胞，用撿卵洗卵緩沖液清洗3 次，準備成熟培養。

1.3.2 卵母細胞的成熟培養

在3 cm直徑培養皿中，用成熟培養基做成多個液滴，每個液滴60 μL。成熟培養所用培養基為M16，主要成分如下：二水氯化鈣0.251 37 g/L，無水硫酸鎂0.164 9 g/L，氯化鉀0.356 35 g/L，磷酸氫鉀0.162 g/L，碳酸氫鈉2.101 g/L，氯化鈉5.531 93 g/L，牛白蛋白4.0 g/L，丙酮酸鈉0.036 3 g/L，葡萄糖1.0 g/L，乳酸鈉2.95 g/L，酚紅0.010 6 g/L。液滴做好后，蓋上一層礦物油，避免培養液中的水分蒸發，影響滲透壓，加蓋礦物油后的液滴見圖1。成熟培養前在37℃，5% CO2培養箱中至少平衡4 h［1］。將1.3.1 步驟中清洗干凈的卵母細胞轉移到成熟培養液的液滴中，每個液滴培養20 個卵母細胞。在倒置顯微鏡下拍照，觀察GV期卵母細胞形態。拍照后將培養皿迅速放入37 ℃，5% CO2培養箱中成熟培養16 ～18 h。取出培養皿置于倒置顯微鏡下拍照，觀察統計GV 期、GVBD期和MII期的卵母細胞。

圖1 加蓋礦物油后的液滴

1.3.3 Hoechst33342 染色

收集卵母細胞，加入Hoechst33342 染色液染色2 min后可直接在熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

2 實驗結果

2.1 GV期卵母細胞

GV期卵母細胞屬于初級卵母細胞階段，減數分裂Ⅰ啟動后經歷前期Ⅰ的細線期、偶線期、粗線期并停留在雙線期，此時期內去掉顆粒細胞的裸卵，細胞核清晰可見，形態特征與洪燈等描述［2］一致。細胞核大，呈圓球形，染色質高度疏松，核膜完整且明顯，含有折光強的核仁，胞漿中心稍變黑并呈顆粒狀（見圖2）。

圖2 GV期卵母細胞

2.2 GVBD卵母細胞

生發泡破裂標志著卵母細胞減數分裂恢復的開始，其形態特征與王憲的描述一致［3］。此時期核膜破裂，完全解散，核仁消失，原來位于核內的物質與核質混合在一起（見圖3）。

圖3 GVBD期卵母細胞

2.3 MⅡ卵母細胞

卵母細胞發生生發泡破裂后，染色體凝聚并排列在中央赤道板上，此時為第1 次減數分裂的中期，之后著絲粒與微管及微管組織中心結合，微管從此中心伸出到達核基質，著絲粒與每對同源染色體的單體相連，形成紡錘體。之后卵母細胞在細胞核動物極附近排出第1 極體。由于這是一次不均等分裂，產生的2 個細胞大小不均等，被稱為極體的是小細胞。大細胞是次級卵母細胞，次級卵母細胞進入第2 次減數分裂并停滯在MⅡ期（見圖4）。第1 極體的排出標志著卵母細胞核的成熟。

圖4 MⅡ期卵母細胞

2.4 Hoechst33342 細胞核染色

為了進一步觀察第1 極體的排出情況，在顯微鏡下通過口吸管挑選排出第1 極體的卵母細胞，置于Hoechst33342 細胞核染色液中進行染色，染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。可見發出熒光的卵母細胞核和極體核（見圖5）。

圖5 MⅡ期卵母細胞Hoechst33342顯示細胞核

3 討 論

3.1 實驗開設的現狀

卵母細胞的體外成熟技術是動物繁殖領域以及生殖醫學實驗室的常用技術，此知識點已經成為生命科學領域本科畢業生學習和工作的常用技術。但是，目前大部分高校生物科學專業僅有相關理論課開設，實驗課還基本處于空白狀態，因此針對生物科學專業本科生開設本實驗是非常有必要的，并且隨著教學改革的深入和國家對創新型人才的需求，各高校對實驗教學越來越重視，并逐漸把科研前沿技術融入本科生的實驗教學中［4］。本實驗的開設不僅可以通過理論與實踐的結合，加深對理論知識的深入理解；掌握本實驗技術還有助于以后的學習和相關工作的開展。

3.2 實驗的注意事項

（1）米力農抑制卵母細胞體外自發成熟。研究表明，卵泡液中含有能夠抑制卵母細胞成熟的物質，如次黃嘌呤，cAMP和磷酸二酯酶等［5］，這些卵母細胞成熟抑制劑使得哺乳動物體內的卵母細胞，可以在排卵前長時間停留在第1 次減數分裂的雙線期，排卵前，在促性腺激素的作用下，卵母細胞減數分裂恢復，生發泡破裂。而GV期卵母細胞被釋放到不含激素的培養液中，也能夠恢復減數分裂，這種現象叫自發成熟。米力農是一種磷酸二酯酶的抑制劑，能有效抑制卵母細胞體外自發成熟［6］。在卵母細胞成熟培養前的操作中，米力農的少量添加可通過特異性抑制磷酸二酯酶的活性，阻止cAMP降解，阻滯卵母細胞成熟分裂，使體外分離的卵母細胞細胞質和細胞核協同成熟［7］，在成熟培養前處于相同的時期，以便在成熟培養后獲得同期成熟的卵母細胞。除此之外，米力農還可以提高核移植過程中的去核率，提高胚胎發育率，增加克隆胚的產量［8-9］，未見明顯的負面作用。

（2）M16 培養基的提前平衡。由于成熟培養時，培養基液滴較小，很容易受到外界環境的影響，因此在成熟培養前需要提前做好液滴，蓋上礦物油，避免培養液中的水分蒸發，影響滲透壓，并在37 ℃，5% CO2培養箱中至少平衡4 h。

（3）所用礦物油純度要高。如果礦物油不純，一些水溶性物質從礦物油中進入培養液，將會影響培養液的成分［1］，整個液滴只有60 μL，緩沖能力較低，卵母細胞成熟質量很容易受到影響。

（4）獲得裸卵。釋放卵母細胞后，用移液槍多次輕輕吹打，以去掉顆粒細胞，獲得裸卵。

3.3 教學的組織安排

本實驗因為小鼠體外成熟時間為16 ～18 h，這個時間要求比較嚴格，所以可以分成兩次實驗，總共安排8 學時。第1 次實驗安排在下午從培養液準備，小鼠處死，卵巢分離到卵母細胞收集共需要4 學時，下午5：00 左右放入培養箱進行培養。第2 次實驗也需要4學時，安排在第2 天上午，教師進行卵母細胞不同成熟階段的講解后，大約9：00 從培養箱取出體外成熟的卵母細胞，在倒置顯微鏡下進行觀察拍照，進一步區別GV期卵母細胞，GVBD卵母細胞和MⅡ卵母細胞。并收集排出第一極體的卵母細胞進行Hoechst33342 染色，2 min 后倒置顯微鏡下進一步觀察經過減數分裂的卵母細胞其細胞核的變化并拍照。

4 結 語

生殖細胞減數分裂是生物科學專業本科生的學習重點，理解起來也有一定難度，由于種種原因，據了解，目前高校生物科學專業中開設這個實驗的并不多，該實驗的開設在幫助學生理解減數分裂以及卵母細胞成熟過程方面具有重要的意義，因此生物科學專業細胞生物學實驗或者發育生物學實驗中本實驗的開設非常有必要，對生物科學創新型科研人才的培養具有重大的促進作用，尤其是針對生物科學創新實驗班的開設，將與其專業培養目標高度契合［10］，通過完善實驗教學內容，提高學生創新實踐能力［11］，有效克服傳統教學中重知識輕實踐，重理論輕操作的現象［12-15］。并且隨著生物科學專業畢業生就業范圍的不斷擴大，部分畢業生畢業后進入大型動物繁殖場或者醫院生殖中心工作，此實驗的開設也是這部分學生的實際需求。從實際操作情況來看，本實驗所涉及卵母細胞各時期的特征清晰，示教效果非常好，所需時間較短，比較容易安排實驗，所以本實驗的開設是完全可行的。