喹諾酮配合物材料的制備及其抗菌性能研究*

夏姣云,李瀟瀟,徐 彤,楊 燦

(長沙理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,長沙 410114)

0 引 言

癌癥是現(xiàn)代致死率最高的流行病之一。據(jù)研究,所有癌癥中有近1/5的感染源都是微生物感染,因其感染而導(dǎo)致的各種疾病,都嚴(yán)重威脅著人類健康[1-5]。細(xì)菌感染可以用抗生素治愈,這對癌癥的預(yù)防也具有重要意義。金屬配合物作為有效藥物的廣泛使用,例如癌癥治療藥物[6]、抗炎藥[7]、降糖藥或抗菌劑和診斷劑[8-9],表明金屬離子的細(xì)胞毒性可以通過適當(dāng)?shù)呐潴w選擇得到很好的控制。喹諾酮類是具有優(yōu)異配合特性的合成化合物,可作為雙齒配體、單齒配體和橋聯(lián)配體與金屬離子結(jié)合形成配合物[10-12]。喹諾酮類藥物與金屬離子的相互作用,可以獲得許多與母體喹諾酮類化合物具有同等或更強(qiáng)的抗菌活性的金屬配合物[13-15]。鉑、釕、鈷、鈀、銅和其他d-嵌段金屬離子的配合物已在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用。但是鉑類抗癌藥物有很強(qiáng)的副作用,如周圍神經(jīng)病變、脫發(fā)和患者的骨髓毒性等。因此研究人員致力于開發(fā)可提供不同作用模式和改善抗癌活性的替代金屬藥物,而銅離子異于鉑類化合物的特殊生物活性使其脫穎而出,銅很容易在還原態(tài)Cu(Ⅰ)和氧化態(tài)Cu(Ⅱ)之間循環(huán),是生物系統(tǒng)、生命活動(dòng)甚至生物細(xì)胞成分中不可或缺的重要元素[16-17]。銅配合物的抗腫瘤活性早在幾十年前就已被報(bào)道,許多新的配合物已顯示出巨大的抗菌、抗腫瘤潛力[18-20]。銅配合物可能比鉑類藥物的副作用相對較低,并被認(rèn)為能夠克服順鉑的遺傳和獲得性耐藥性。本文選用喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星作為第一配體,苯并咪唑類化合物作為第二配體,通過微波輔助合成法合成新型三元銅配合物,并將銅配合物用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測試。研究結(jié)果表明,配合物與單一的喹諾酮類抗生素具有更強(qiáng)的抗菌活性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑按照文獻(xiàn)[21]合成;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、溴化乙錠(EB)均為生化試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;小牛胸腺DNA：生化試劑,索萊寶生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)：生化試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)：生化試劑,上海麥克林生化科技有限公司;環(huán)丙沙星、高氯酸銅六水合物,上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑為市售的分析試劑,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。研究配合物與牛血清白蛋白作用時(shí),底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L;研究配合物與牛血清白蛋白作用時(shí),底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L。

1.2 配合物的合成

取0.3313 g(1 mmol)環(huán)丙沙星溶于10 mL水中,并用等摩爾量的NaOH中和,再加入0.2416 g(1 mmol)Cu(NO3)2·3H2O,室溫?cái)嚢?混合均勻。再將溶有0.2091 g(1 mmol)HPBM用30 mL乙醇溶解,再用(0.2 mol/L)NaOH 調(diào)節(jié)pH值至5～6,將混合溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,置于120 ℃油浴中,冷凝回流1.5 h,冷卻過濾,棄去淺綠色固體。濾液在室溫下放置,數(shù)周后有藍(lán)綠色晶體析出,乙醇重結(jié)晶,空氣中干燥后置于干燥器中保存。

圖1 化合物SF-Cu-HPBM結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the compound SF-Cu-HPBM structure

1.3 樣品的性能及表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)

通過FT-IR光譜儀分析樣品的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分,Nicolet iS20型,上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3.2 元素分析儀(EA)

通過元素分析儀分析環(huán)丙沙星和SF-Cu-HPBM的元素組成和含量,Elementar UNICUBE型,德國元素-艾力蒙塔貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3.3 紫外分光光度計(jì)(UV-Vis)

通過紫外分光光度計(jì)分析環(huán)丙沙星和SF-Cu-HPBM的光吸收性能以及與小牛胸腺DNA的作用,F7000型,日本日立公司。

1.3.4 高分辨質(zhì)譜儀(ESI-MS)

通過ESI-MS測試SF-Cu-HPBM的組成,Waters G2-XS Qtof型,沃特世科技(美國)有限公司。

1.3.5 精密電導(dǎo)率儀

通過電導(dǎo)率儀分析化合物的電解質(zhì)類型,MP515-03型,上海三信儀表廠。

1.3.6 熒光分光光度計(jì)

通過熒光分光光度計(jì)分析配合物與DNA結(jié)合的方式,F7000型,美國Millipore System (Biocel) 公司。

1.3.7 烏氏粘度計(jì)

通過烏氏粘度計(jì)分析配合物與DNA的作用,PH-010A 型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物表征

2.1.1 紅外光譜分析

室溫下,測定了配體環(huán)丙沙星、及配合物SF-Cu-HPBM在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。喹諾酮為第一配體,苯并咪唑類為第二配體的紅外分析結(jié)果見表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)SF-Cu-HPBM配合物分別在3 474.39 cm-1出現(xiàn)吸收峰,而環(huán)丙沙星配體中未出現(xiàn),這歸因于配合物-NH2+的伸縮振動(dòng)ν—NH2+及結(jié)合水的O-H伸縮振動(dòng)峰ν—O—H。(2)環(huán)丙沙星在3 043.87 cm-1出現(xiàn)了吸收峰,這是哌嗪基上N—H的伸縮振動(dòng)v—NH,而SF-Cu-HPBM配合物分別在2979.78 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,這是第二配體咪唑環(huán)上N-H的伸縮振動(dòng)ν—NH。(3)環(huán)丙沙星在1 613.96 cm-1(νC=O)、1 498.28 cm-1(νC—OH)、1 372.60 cm-1(νas(COO—))三處表現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰,這歸因于羧基的C=O伸縮振動(dòng)、C—OH的伸縮振動(dòng)和COO-的對稱伸縮振動(dòng)。在配合物中并沒有出現(xiàn)—COO—的3個(gè)特征吸收峰,由于形成配合物,羧基峰特征峰向低波數(shù)方向位移,SF-Cu-HPBM配合物在1 627.25,1 461.83,1 292.23 cm-1處分別表現(xiàn)3個(gè)強(qiáng)吸收峰,分別歸屬于C=O的伸縮振動(dòng)(νC=O)、—COO—的不對稱伸縮振動(dòng)νas(COO—)和對稱伸縮振動(dòng)νas(COO—),這意味著第一配體環(huán)丙沙星中的羧酸基團(tuán)脫去了H離子,并通過COO-陰離子單齒與中心銅離子配位。(4)另外,SF-Cu-HPBM配合物在511.52、429.20 cm-1處分別表現(xiàn)的兩個(gè)吸收峰為Cu-O和Cu-N的伸縮振動(dòng),這進(jìn)一步表明兩種配體均與中心銅離子發(fā)生了配位。

表1 苯并咪唑類配合物與配體的紅外特征峰Table 1 Infrared characteristic peaks of benzimidazole complexes and ligands

2.1.2 元素分析

元素分析是研究有機(jī)化合物中元素組成和含量的化學(xué)分析方法。根據(jù)比較理論與實(shí)際合成化合物中C、H、N 3種元素的百分含量,來分析化合物是否與預(yù)期一致。如表2所示,配合物中各元素的實(shí)驗(yàn)測定值與計(jì)算值較為吻合,百分含量相差不大,與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 5種配合物的元素分析數(shù)據(jù)Table 2 Elemental analysis data of five complexes

2.1.3 紫外光譜分析

室溫下,測定了配合物的DMSO溶液(1×10-2～1×10-5mol/L)在200～450 nm和450～800 nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。如表3所示,配合物與配體的DMSO溶液在近紫外區(qū)283.00～284.50 nm和331.50～332.00 nm處均有2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,這是由于配體和配合物的π→π*躍遷。研究發(fā)現(xiàn),配體和配合物最大吸收峰的位置并未發(fā)生改變,但吸收峰的強(qiáng)度卻有所減弱,這是由于金屬離子與配體配位后,氮原子的電子云密度的降低。其次,發(fā)現(xiàn)配合物在可見光區(qū)673.80 nm出現(xiàn)了配體中不含有的弱而寬的吸收峰,這是由于配合物分子中心Cu離子的d→d躍遷。

表3 配合物與配體的紫外光譜數(shù)據(jù)Table 3 UV spectral data of complexes and ligands

2.1.4 質(zhì)譜分析

室溫下,測定了配合物乙腈溶液(1×10-5mol/L)的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)。如圖2,在SF-Cu-HPBM配合物的質(zhì)譜圖中顯示,存在正離子峰m/z為604.39,推測配合物溶液中存在配離子[Cu(SF)(HPBM)]2+。

圖2 配合物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of complexes

2.1.5 摩爾電導(dǎo)率

在室溫25 ℃下,測定配合物在甲醇和DMSO溶液中(1×10-3mol/L)的摩爾電導(dǎo)率分別為172.3和72.3 S·cm2/mol,配合物為1：2型電解質(zhì)。

2.2 新型三元銅配合物的抗菌性能

2.2.1 最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)測定了配合物與配體對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能,它們的體外活性數(shù)據(jù)如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物的抗菌活性優(yōu)于喹諾酮類抗生素配體的抑菌性能,第二配體HPBM的抑菌效果不是很明顯,而Cu(ClO4)2·6H2O也表現(xiàn)出優(yōu)異的抑菌性能。配合物SF-Cu-HPBM與環(huán)丙沙星相比,大腸桿菌(0.098 μg/mL<0.178 μg/mL)和對金黃色葡萄球菌(0.102 μg/mL<0.425 μg/mL)都有更好的活性。

表4 配合物與配體的最小抑菌濃度MICTable 4 MIC of complexes and ligands

2.2.2 抑菌效果實(shí)驗(yàn)

(1)平板涂布法

將配體、配合物藥液與菌液共同孵育4 h,平板涂布培養(yǎng)24 h后,各菌落的生長情況如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)從圖3中可以看出,相比于空白組和陰性對照組,第一配體環(huán)丙沙星組的大腸桿菌菌落明顯減少,但是仍有一些菌落分布于固體培養(yǎng)基的四周,說明第一配體對于大腸桿菌具備一定的殺菌效果,且殺菌效果良好。第二配體HPBM沒有明顯的殺菌效果。而相較于第一配體,配合物SF-Cu-HPBM將所有細(xì)菌都?xì)⑺懒?未長出任何菌落。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對大腸肝菌的抑菌性能明顯高于單一的喹諾酮抗生素;(2)從圖4中可以看出,相比于空白組和陰性對照組,環(huán)丙沙星組金黃色葡萄球菌菌落有所減弱,但抑菌效果不是很完全,HPBM配體也幾乎未顯現(xiàn)出抑菌性能,而合成的SF-Cu-HPBM配合物抑制了所有菌落的生長。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對金黃色葡萄球菌也達(dá)到了很好的抑菌效果。

圖3 喹諾酮-銅-苯并咪唑類配合物、配體對大腸桿菌的生長情況的影響圖：(a)為空白對照組;(b)為陰性對照組;(c)為配體HPBM組;(d)為環(huán)丙沙星(SF)組;(e)為喹諾酮-銅-苯并咪唑類(SF-Cu-HPBM)組Fig.3 Effect of quinolone-copper-benzimidazolium complexes and ligands on the growth of E.coli Figure：(a) blank control group;(b) negative control group;(c) ligand HPBM group;(d) ciprofloxacin (SF) group;(e) quinolone-copper-benzimidazolium complex (SF-Cu-HPBM) group

(2)抑菌圈

采用濾紙片法研究了各配體及銅配合物(20 μg/mL)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,結(jié)果以抑菌圈直徑來表示。每個(gè)培養(yǎng)皿都放置了相應(yīng)的配體與配合物,更直觀的比較配合這一作用方式,是否能夠在喹諾酮抗生素抗菌活性的基礎(chǔ)上得到提高。如圖5(a)和 (b)所示,明顯看出,配合物4位上的抑菌圈直徑明顯大于1位上的,抑菌效果明顯提高,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 新型三元銅配合物與DNA的相互作用

2.3.1 DNA紫外滴定分析

紫外滴定分析法應(yīng)用廣泛,操作簡便,是探究生物大分子(DNA/蛋白質(zhì))與過渡金屬離子之間的相互作用的有力手段,不僅能夠判斷兩者之間的作用模式,還能夠準(zhǔn)確地表征作用強(qiáng)度。當(dāng)配合物與DNA作用,雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,則會(huì)產(chǎn)生增色效應(yīng);若配合物與DNA作用,而導(dǎo)致分子構(gòu)象變化,則會(huì)產(chǎn)生紅移和減色效應(yīng),作用越強(qiáng)減色效果越明顯。

由圖6可知,配合物、配體與DNA作用均產(chǎn)生明顯的紅移和減色效應(yīng)。這可能歸因于配合物插入DNA堿基對中,發(fā)生電子堆積,配合物作用配體的π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生耦合,能級下降,產(chǎn)生π→π*躍遷。如圖6(a)所示,隨著DNA濃度的升高,苯并咪唑類為第二配體的配合物SF-Cu-HPBM在277 nm處產(chǎn)生了33.66%的減色;如圖6(b)所示,環(huán)丙沙星在273.5 nm處產(chǎn)生了8.03%的減色效應(yīng)。新型三元銅配合與DNA的作用明顯高于單一的喹諾酮類化合物。配合物、配體與DNA作用的大小為SF-Cu-HPBM>環(huán)丙沙星。配合物、配體與DNA作用的紫外光譜數(shù)據(jù)見表5。

圖6 配合物、配體與DNA相互作用的紫外光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(b)為SF與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(a)(b)兩圖中,曲線1為游離的待測樣品的吸收曲線,曲線2-12為不同DNA濃度下的吸收光譜Fig.6 UV spectra of the interaction between the complexes,ligands and DNA：(a) the UV spectra of the interaction between SF-Cu-HPBM and the DNA;(b) the UV spectra of the interaction between SF and the DNA;(a) (b) in both figures,curve 1 is the absorption curve of the free sample to be tested,and curves 2-12 are the absorption spectra at different DNA concentrations

2.3.2 EB競爭實(shí)驗(yàn)分析

溴化乙錠(EB)是一種因其物理性質(zhì)和生物活性而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的熒光化合物。它是一種具有抗病毒特性的錐蟲染料,可插入核酸雙螺旋區(qū)域的相鄰堿基對之間。通過嵌入,EB的熒光量子產(chǎn)率顯著提高,它與DNA形成的體系在可見光區(qū)顯示出光學(xué)活性。當(dāng)DNA-EB體系被DNA-待測物體系所替代,EB從DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中游離出來,熒光被猝滅。利用這種方法進(jìn)一步研究兩者之間的相互作用。

由圖7可知,在僅有待測樣品或DNA時(shí),在332 nm的激發(fā)光下,580～600 nm處都沒有熒光產(chǎn)生。而DNA-EB體系在580～600 nm處顯示出熒光,這說明EB已經(jīng)嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中。隨著待測樣品的不斷加入,DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度明顯減弱,這說明了DNA-EB體系被DNA-待測物體系所替代,待測樣品與DNA很可能是通過經(jīng)典插入模式相結(jié)合。

2.3.3 牛血清蛋白實(shí)驗(yàn)分析

熒光分析是評價(jià)金屬配合物與牛血清白蛋白相互作用的一種有效方法。許多蛋白質(zhì)的特征熒光都主要由色氨酸貢獻(xiàn)。在牛血清白蛋白中,熒光發(fā)射強(qiáng)度取決于兩個(gè)色氨酸側(cè)鏈134和212在極性溶劑中的暴露程度。銅配合物的加入能夠使BSA體系熒光產(chǎn)生規(guī)律性猝滅,觀察BSA最大發(fā)射峰的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象,可以進(jìn)一步分析待測樣品與BSA的作用關(guān)系。從圖8中可以看出,隨著配合物與配體的加入,BSA的熒光強(qiáng)度都發(fā)生了不同程度的猝滅。

圖8 配合物、配體與BSA作用的熒光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配合物待測樣品濃度(濃度控制為10～150 μmol/L)的吸收曲線;(b)為SF與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配體待測樣品濃度(濃度控制為10-150 μmol/L)的吸收曲線Fig.8 Fluorescence spectra of the interaction between the ligands and BSA：(a) shows the fluorescence spectra of SF-Cu-HPBM with BSA,curve 1 shows the fluorescence curve of BSA,curves 2-8 show the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration control 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time;(b) shows the fluorescence spectra of SF with BSA fluorescence spectra,curve 1 is the fluorescence curve of BSA,and curves 2-8 are the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration controlled as 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time

圖9和表6是配合物、配體與BSA相互作用的熒光變化趨勢和光譜數(shù)據(jù),更直觀的闡明了各種化合物與BSA的作用強(qiáng)度。根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算得出各種配合物、配體與BSA作用的Ksv,配合物與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ksv為2.36×105M-1,明顯高出第一配體環(huán)丙沙星與BSA的結(jié)合力3.85×103M-1,表明BSA在承擔(dān)藥物分子血液運(yùn)輸?shù)冗^程中,更易與配合物產(chǎn)生作用,抵達(dá)靶細(xì)胞。

表6 配合物、配體與BSA相互作用的熒光光譜數(shù)據(jù)Table 6 Fluorescence spectrum data of complexes,ligands and BSA interactions

圖9 不同濃度化合物下BSA體系熒光的變化趨勢Fig.9 Variation trend of fluorescence in BSA system under different concentrations of compounds

3 結(jié) 論

(1)成功合成了喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星為第一配體、苯并咪唑類化合物為第二配體的銅離子配合物。配合物可能的分子式為：[Cu(SF)(HPBM)](NO3)2·1.5H2O。

(2)結(jié)合紅外光譜、紫外光譜、電噴霧質(zhì)譜、元素分析以及摩爾電導(dǎo)率的測試結(jié)果表明,喹諾酮類配體是通過4-位羰基氧原子、3-位羧基氧原子與銅離子配位,苯并咪唑類配體是通過芳香雜環(huán)上的兩個(gè)氮原子與銅離子配位,配合物性質(zhì)穩(wěn)定、性能優(yōu)異。

(3)將新型三元銅配合物,用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測試,發(fā)現(xiàn)配合物比單一的喹諾酮類抗生素具有更強(qiáng)的抗菌活性。

(4)通過研究新型三元銅配合物與小牛胸腺DNA的作用及DNA-EB競爭實(shí)驗(yàn),證明了配合物以經(jīng)典插入模式與DNA結(jié)合。并且在牛血清蛋白實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)配合物與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合常數(shù)為2.36×105M-1,第一配體環(huán)丙沙星與BSA的結(jié)常數(shù)為3.85×103M-1,明顯看出配合物與BSA的結(jié)合能力高于與配體與BSA的結(jié)合能力,表明BSA在承擔(dān)藥物分子血液運(yùn)輸?shù)冗^程中,更易與配合物產(chǎn)生作用,抵達(dá)靶細(xì)胞。