枸杞糖肽通過抑制鐵死亡減輕高血糖大鼠腦缺血/再灌注損傷

李 鵬,楊 晶,馬艷梅,張建忠,景 麗

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系、2. 總醫(yī)院放射科,寧夏 銀川 750004)

高血糖是急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。與正常血糖水平患者相比,高血糖對卒中患者的影響體現(xiàn)在疾病診療的全過程,包括更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)、更廣泛的梗死面積和更高的病死率、致殘率及復(fù)發(fā)率[2]。研究高血糖狀態(tài)下腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)的發(fā)病機(jī)制及其有效的防治策略對于合并高血糖AIS患者的綜合管理具有重要意義。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡在CIRI中發(fā)揮重要作用,抑制鐵死亡可能減輕CIRI[3-4]。

枸杞具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié),以及保護(hù)心腦血管疾病等作用[5]。枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide,LbGp)是從枸杞多糖中進(jìn)一步分離出的一種具有免疫活性的糖綴合物,包含5種組分,其分子量為88 ku。研究顯示,枸杞多糖通過提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的活力,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮CIRI后的腦保護(hù)作用[6]。由于鐵死亡是由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的一種獨(dú)特的程序性細(xì)胞死亡形式,我們推測LbGp可能具有調(diào)控鐵死亡的作用。然而,LbGp是否能夠通過抑制鐵死亡減輕高血糖狀態(tài)下的CIRI,目前尚不清楚。因此,本研究采用線栓法建立體內(nèi)慢性高血糖大鼠左側(cè)短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R)模型,模擬臨床高血糖狀態(tài)下AIS患者機(jī)械取栓手術(shù)后的腦缺血/再灌注病理生理過程,并使用鐵死亡抑制劑去鐵酮(deferiprone,DFP)作為陽性對照藥物,探討LbGp是否通過調(diào)控鐵死亡的相關(guān)靶點(diǎn)抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI,以期為高血糖狀態(tài)下CIRI的診治提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠,♂,體質(zhì)量(240～270) g,購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(寧)2020-0001]。大鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房,室溫(21～23) ℃,12 h/12 h光/暗交替,自由獲取水和食物。本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):IACUC-NYLAC-2021-047)。

1.2 主要試劑與儀器LbGp粉末(中寧枸杞院士工作站寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司);去鐵酮片(Apotex Inc., Etobicoke site);組織鐵測定試劑盒(貨號(hào):A039-2-1),購自南京建成生物工程研究所;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide,GSSG)檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒(貨號(hào)分別為S0053、S0101S、S0131S、S0121),均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1)抗體(貨號(hào):TA5343),購自Abmart;二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalent metal transporter 1,DMT1)抗體、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportin 1,FPN1)抗體(貨號(hào)分別為20507-1-AP、26601-1-AP),均購自Proteintech公司;脂酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)抗體、二抗(貨號(hào)分別為ab155282、ab6721),均購自Abcam公司;谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體(貨號(hào):NBP2-75511),購自Novus;β-actin抗體(貨號(hào):#4970S),購自Cell Signaling Technology公司。大鼠專用線栓(北京西濃科技有限公司);Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Signa Architet 3.0T MRI掃描儀(美國通用電氣公司);石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);光學(xué)及熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 大鼠高血糖模型的建立各組大鼠置于籠盒中預(yù)適應(yīng)3 d,禁食12 h,稱體質(zhì)量,以60 mg·kg-1腹腔注射冰上現(xiàn)配的含鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的檸檬酸緩沖液,之后放回籠盒,自由進(jìn)食和飲水。分別于3 d、7 d后,取大鼠尾靜脈血,檢測血糖值,以血糖值 >16.8 mmol·L-1為建立高血糖模型成功。

1.4 大鼠tMCAO/R模型的建立建立經(jīng)左側(cè)頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)—頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)—大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)途徑的tMCAO/R模型。首先,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉大鼠,麻醉后大鼠仰臥位固定;然后,頸部正中線略偏左側(cè)行手術(shù)切口,依次鈍性分離并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、ICA和ECA,用小型動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA遠(yuǎn)端和ICA近端,在ECA兩結(jié)之間用眼科剪剪一小口,并將適合體質(zhì)量的線栓緩慢插入ECA,后經(jīng)ICA入顱至MCA開口處,固定線栓;最后,在缺血30 min后將線栓輕輕拔出,確保拔出的線栓頭部完整,結(jié)扎ECA,消毒并逐層縫合皮膚。假手術(shù)組除不插栓線外,其余步驟同tMCAO/R模型。

1.5 動(dòng)物分組與給藥大鼠隨機(jī)分為高血糖假手術(shù)組(Sham,n=6)、高血糖tMCAO/R組(HG,n=8)、高血糖枸杞糖肽預(yù)處理tMCAO/R組(LbGp,n=8)、高血糖去鐵酮陽性藥物對照tMCAO/R組(DFP,n=8)。每組各有3只大鼠用于Western blot實(shí)驗(yàn)。本研究LbGp和DFP的給藥時(shí)間點(diǎn)選擇在注射STZ后的第8天,以更真實(shí)地模擬臨床實(shí)際,大鼠每天灌胃1次,連續(xù)灌胃3周。每次灌胃前,將LbGp和DFP充分溶于大鼠無菌飲用水中。參照文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn),LbGp的給藥劑量為20 mg·kg-1·d-1[7],DFP的給藥劑量為75 mg·kg-1·d-1[8]。

1.6 神經(jīng)功能缺損評分采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity score,mNSS)法[9],全面評價(jià)大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。mNSS項(xiàng)目主要包括運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)(提尾實(shí)驗(yàn)和行走實(shí)驗(yàn))、感覺實(shí)驗(yàn)(本體感覺實(shí)驗(yàn)和放置實(shí)驗(yàn))、平衡木實(shí)驗(yàn)和反射實(shí)驗(yàn)4個(gè)方面。mNSS總分18分,0分為神經(jīng)功能正常,18分為神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重。tMCAO/R模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)為mNSS≥4分,且同時(shí)具備4個(gè)方面評分項(xiàng)目神經(jīng)功能均有缺損。

1.7 腦組織鐵含量、GSH/GSSG比值、SOD活性、T-AOC及MDA含量的檢測均使用相應(yīng)試劑盒檢測,各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照說明書操作。

1.8 腦梗死體積測量采用磁共振T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging,T2WI)法和TTC染色法測定腦梗死體積,通過ImageJ軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。T2WI檢查:大鼠麻醉后,俯臥位固定于大鼠專用頭部線圈內(nèi),行T2WI冠狀位掃描,掃描范圍包括嗅球至上段頸髓;掃描參數(shù)重復(fù)時(shí)間2 257 ms,回波時(shí)間84.6 ms,層厚2 mm,層數(shù)12,視野80 mm×80 mm,矩陣288×192;腦梗死區(qū)表現(xiàn)為異常高信號(hào),正常腦實(shí)質(zhì)表現(xiàn)為等信號(hào)。TTC染色:MRI檢查后麻醉處死,迅速取腦,去除嗅球和小腦,-20 ℃冷凍20 min,行冠狀面薄層切片后,放于新鮮配制的TTC溶液中,避光37 ℃孵育30 min,期間翻動(dòng)2次,然后4%多聚甲醛溶液固定,過夜后拍照;TTC染色腦梗死區(qū)表現(xiàn)為白色,非梗死區(qū)表現(xiàn)為紅色。

1.9 HE染色大鼠取材后,經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制作成石蠟切片(厚約4 μm)。然后,依次經(jīng)烘烤、脫蠟和水化,蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色,最后脫水、透明、封片,并于光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)形態(tài)改變。

1.10 普魯士藍(lán)染色(增強(qiáng)型)切片依次經(jīng)脫蠟、水化、Perls染色工作液、孵育工作液、增強(qiáng)工作液、復(fù)染、脫水、透明、封片后,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.11 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色切片依次經(jīng)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和山羊血清封閉后,分別加入一抗TFR1、DMT1、FPN1(均1 ∶200),然后孵育二抗,最后顯色、復(fù)染、脫水、透明和封片。置于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察,采用ImageJ軟件測量目的蛋白的平均光密度值。

1.12 Western blot檢測提取大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)總蛋白,并定量、變性。以10 μL體系上樣,依次經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入一抗TFR1(1 ∶1 000)、DMT1(1 ∶800)、FPN1(1 ∶1 000)、ACSL4(1 ∶10 000)、GPX4(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000),然后二抗(1 ∶5 000)孵育、曝光。采用ImageJ軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損和氧化應(yīng)激損傷的影響大鼠腦缺血30 min,再灌注24 h后,Tab 1檢測結(jié)果表明,Sham組大鼠mNSS為0,HG組大鼠mNSS明顯升高(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組大鼠mNSS均明顯降低(P<0.01)。此外,與Sham組相比,HG組大鼠GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC均明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組大鼠GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC均明顯升高(P<0.05,P<0.01),MDA含量明顯降低(P<0.01)。

2.2 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦梗死體積的影響基于動(dòng)物福利,最大化減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)量。實(shí)驗(yàn)前先選擇3只正常血糖大鼠,通過磁共振T2WI法和病理TTC染色法,觀察腦梗死范圍。結(jié)果顯示(Fig 1),T2WI法和TTC染色法測量的腦梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇磁共振T2WI法測量腦梗死體積。如Fig 2所示,Sham組大鼠T2WI左右兩側(cè)大腦半球腦實(shí)質(zhì)信號(hào)正常,未見異常高信號(hào),且中線結(jié)構(gòu)居中,兩側(cè)側(cè)腦室對稱、無擴(kuò)張表現(xiàn);與Sham組相比,HG組、LbGp組和DFP組大鼠T2WI左側(cè)大腦半球腦實(shí)質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的異常高信號(hào),并以HG組信號(hào)強(qiáng)度最高(提示血管源性腦水腫最嚴(yán)重),且HG組伴有左側(cè)腦室受壓變窄、右側(cè)腦室擴(kuò)張積水及中線結(jié)構(gòu)局部右偏。與HG組相比,LbGp組和DFP組腦梗死體積百分比均減小(P<0.01,P<0.05)。

2.3 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦組織病理學(xué)變化的影響如Fig 3所示,Sham組HE染色神經(jīng)元核呈圓形,核仁居中,胞質(zhì)豐富,胞質(zhì)著色均勻;HG組神經(jīng)元胞質(zhì)染色變淺,大部分神經(jīng)元呈空泡樣改變,間質(zhì)水腫明顯;LbGp組和DFP組較HG組神經(jīng)元形態(tài)改變和間質(zhì)水腫程度有所緩解。與Sham組相比,HG組皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)核固縮神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組核固縮神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P<0.01,P<0.05)。

Tab 1 Effects of LbGp on mNSS, GSH/GSSG ratio, SOD activity, T-AOC and MDA contents in hyperglycemic rats

Fig 1 Comparison of T2WI and TTC staining for showing cerebral infarction volume in normoglycemic rats ( n=3)

Fig 2 Effect of LbGp on cerebral infarction volume in hyperglycemic rats n=3～5)

2.4 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦組織鐵含量及鐵代謝相關(guān)蛋白的影響普魯士藍(lán)染色結(jié)果(Fig 4A)顯示,Sham組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)可見散在分布的點(diǎn)片狀棕褐色染色,HG組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)可見多發(fā)點(diǎn)片狀或小片狀棕褐色染色,LbGp組和DFP組缺血皮質(zhì)區(qū)均未見異常的棕褐色染色。各組大鼠腦組織鐵含量測定結(jié)果(Fig 4B)顯示,與Sham組相比,HG組腦組織鐵含量明顯增加(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組腦組織鐵含量均明顯降低(P<0.01)。

IHC結(jié)果顯示(Fig 5),與Sham組相比,HG組TFR1、DMT1表達(dá)量均明顯升高(P<0.05,P<0.01),FPN1表達(dá)量明顯下降(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組TFR1、DMT1表達(dá)量均明顯下降(P<0.01,P<0.05),FPN1表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示(Fig 6),各組TFR1、DMT1和FPN1蛋白的表達(dá)趨勢與IHC結(jié)果基本一致。

2.5 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠ACSL4和GPX4蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 7),與Sham組相比,HG組大鼠ACSL4蛋白表達(dá)明顯升高,GPX4蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組ACSL4蛋白表達(dá)明顯降低,GPX4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01)。

3 討論

本研究采用從ECA插線栓的路徑,能夠最大化比擬臨床機(jī)械取栓手術(shù)。結(jié)果表明,高血糖大鼠腦缺血30 min再灌注24 h出現(xiàn)了占位性腦水腫征象,而經(jīng)LbGp干預(yù)后,腦水腫程度明顯減輕。組織病理學(xué)結(jié)果也證實(shí),LbGp能夠通過減少核固縮神經(jīng)元數(shù)量、減輕細(xì)胞及間質(zhì)水腫,改善高血糖大鼠腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致AIS神經(jīng)元功能紊亂和死亡的主要誘發(fā)因素。鐵死亡作為一種由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的獨(dú)特程序性細(xì)胞死亡,其特點(diǎn)是脂質(zhì)過氧化和GSH耗竭[10]。本研究結(jié)果顯示,LbGp通過提高GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC,減輕高血糖腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。正常情況下,細(xì)胞外游離的Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)結(jié)合形成復(fù)合物,被細(xì)胞膜上的TFR1識(shí)別,并進(jìn)一步形成TF-TFR1復(fù)合物。TF-TFR1內(nèi)吞入細(xì)胞后,Fe3+從TF中釋放出來,被前列腺跨膜上皮3抗原抗體還原為Fe2+。隨后,Fe2+通過DMT1運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中的不穩(wěn)定鐵池[11]。細(xì)胞內(nèi)的Fe2+可通過細(xì)胞膜上的FPN1外排輸出細(xì)胞,FPN1是目前唯一已知的鐵外排蛋白[11]。細(xì)胞內(nèi)過量的Fe2+可以催化H2O2生成羥自由基,并可通過芬頓反應(yīng)和鐵依賴性酶產(chǎn)生大量的活性氧,造成細(xì)胞膜的氧化損傷[12]。此外,鐵是脂氧合酶催化亞基的重要組成部分,脂氧合酶活性的增加可介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化[13]。因此,過量的鐵可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。本研究結(jié)果提示,高血糖腦缺血/再灌注大鼠腦組織出現(xiàn)了鐵超載和鐵代謝紊亂,而LbGp能夠改善高血糖腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的鐵超載和鐵代謝紊亂。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡是否參與了高血糖狀態(tài)下腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的腦損傷,本研究檢測了鐵死亡的其他重要調(diào)控因子——ACSL4和GPX4。ACSL4被認(rèn)為是決定鐵死亡敏感性的一個(gè)關(guān)鍵因子,其可調(diào)節(jié)多不飽和脂肪酸的合成,催化花生四烯酸或腎上腺酸酯化為磷脂酰乙醇胺[14],再經(jīng)過一系列的生化反應(yīng),氧化為親鐵性的脂質(zhì)過氧化物而激活細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]。研究顯示,敲除ACSL4可以減輕小鼠CIRI,而過表達(dá)ACSL4則會(huì)通過誘導(dǎo)鐵死亡加重CIRI[16]。GPX4作為一種含硒蛋白,在調(diào)控鐵死亡方面起著關(guān)鍵作用,它能將有毒的膜脂H2O2還原成無毒的脂質(zhì)醇[17]。Hu等[18]研究顯示,β-石竹烯通過下調(diào)ACSL4的表達(dá)、上調(diào)GPX4的表達(dá),抑制鐵死亡,從而發(fā)揮對大鼠CIRI的腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,LbGp能夠通過抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI。

Fig 6 Effects of LbGp on TFR1, DMTI and FPN1 protein expressions in hyperglycemic rats n=3)

Fig 7 Effects of LbGp on protein expressions of ACSL4 and GPX4 in hyperglycemic rats n=3)

綜上所述,本研究通過建立體內(nèi)CIRI動(dòng)物模型,證實(shí)LbGp能夠減輕高血糖大鼠CIRI。之后通過檢測氧化應(yīng)激、鐵含量和鐵代謝相關(guān)蛋白,以及ACSL4、GPX4蛋白表達(dá)等多種鐵死亡關(guān)鍵指標(biāo),證實(shí)LbGp可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、鐵穩(wěn)態(tài)和鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制高血糖大鼠腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的鐵死亡。但本研究未能進(jìn)一步探討LbGp抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI的具體作用機(jī)制,今后應(yīng)從體內(nèi)和體外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行深入研究。