基于網絡藥理學探討膜腎協定方治療特發性膜性腎病的機制

丁秀, 王小琴

湖北省中醫院 湖北中醫藥大學附屬醫院腎病科,湖北省中醫藥研究院腎病研究所,湖北武漢 430061

膜性腎病是指以腎小球基底膜上皮細胞下免疫復合物沉積為特征的一組疾病,伴有腎小球基底膜增厚,排除了繼發性因素的膜性腎病稱為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)[1]。近年來IMN發病逐年增加,常以水腫、蛋白尿、低蛋白血癥、高血壓等為主要臨床表現,且病程長、預后差、易反復發作[2-3]。膜腎協定方是臨床治療IMN的有效方劑[4-5],然而膜腎協定方治療IMN的具體機制尚未清晰。本研究采用網絡藥理學方法探討膜腎協定方治療特發性膜性腎病的分子機制,以期為膜腎協定方的臨床進一步推廣提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 膜腎協定方主要活性成分的作用靶點

本研究通過設置口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)[6]在BATMAN-TCM(中藥分子機理的生物信息學分析工具)、TCMSP(中藥系統藥理學數據庫與分析平臺)、TCMID(中藥綜合數據庫)、Swiss Target Prediction、CNKI等數據庫收集桂枝、茯苓、防己、黃芪、蒼術、白術、柴胡、黃芩、黨參、升麻、三棱、莪術相關成分及靶點,建立膜腎協定方成分及靶點數據庫,用于后續分析。

1.2 IMN相關靶點的預測與篩選

在GeneCards數據庫檢索IMN相關靶點,通過比較毒物基因組學(comparative toxicogenomics database,CTD)數據庫獲取與IMN相關的靶點。將兩個數據庫獲取的IMN相關基因合并刪除重復項,得到IMN相關靶點。再將IMN的靶點與膜腎協定方活性成分靶點映射后取交集,獲得膜腎協定方治療IMN的潛在作用靶點。

1.3 靶點交互作用網絡的構建

使用STRING[7](Version 10.0)在線數據庫進行預測靶點的相互作用。物種設為“Homo sapiens”,對數據進行預讀后將置信度設置為≥0.90,并隱藏孤立蛋白,導出TSV文件。進行拓撲排序算法分析,篩選出蛋白-蛋白互作網絡(protein-protein interaction,PPI)中的關鍵靶點。

1.4 KEGG和GO富集分析

使用R studio的cluster Profiler包[8]對所篩選靶點進行GO和KEGG通路分析,選擇P<0.05的通路。將上述靶點-通路-中藥數據制成Excel表格并導入Cytoscape軟件中,對節點參數及網絡形狀進行設置后繪制膜腎協定方成分調節的網絡圖。

2 結 果

2.1 膜腎協定方活性成分及靶點的收集與篩選

收集到膜腎協定方中的主要活性成分共34個(表1)。從TCMSP獲得466個膜腎協定方靶點,從BATMAN-TCM數據庫獲得1 262個膜腎協定方靶點,從Swiss Target數據庫獲得833個膜腎協定方靶點。去重后得到了1 909個靶點。從GeneCards數據庫獲得8 259個與IMN相關的靶點,從CTD數據庫獲得了23 610個與IMN相關的靶點,去重后得到了24 171個靶點。將疾病數據庫與成分數據庫收集到的靶點映射后共得到1 863個膜腎協定方治療IMN的靶點。

表1 膜腎協定方中的主要活性成分信息表

2.2 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建

將上述1 863個靶點導入STRING數據庫后篩選出148個靶點。以148個靶點作為膜腎協定方在治療IMN過程中的關鍵靶點,并建立PPI網絡圖(圖1),共包括148個節點,3 786條邊。根據PPI網絡圖初步推測,膜腎協定方可能通過HRH1、HTR1A、NR3C1、OPRK1、IL-6、JAK3、F2R、MAPK14、MAPK11、MAPK8、TNF、TGF-β1、AKT1、PIK3CA等148個關鍵靶點防治IMN。

圖1 靶點蛋白-蛋白相互作用網絡圖

2.3 靶點的功能富集分析

KEGG通路分析共得到177條通路,選擇P<0.05的20條(圖2A),148個靶點主要通過神經活性配體-受體相互作用、信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路等治療IMN。將148個靶點進行GO富集,根據P<0.05篩選,148個靶點在生物過程中顯著富集(圖2B、C、D),共參與生物過程2 430個。根據GO生物學過程富集結果,膜腎協定方可能通過調節細胞鈣離子穩態、細胞中的二價無機陽離子穩態、磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號通路、血管直徑的調節、血管收縮調節等生物過程防治IMN。

圖2 KEGG信號通路圖和GO富集圖A為KEGG信號通路圖;B為GO富集生物過程柱狀圖;C為GO富集生物過程重點通路圖;D為GO富集生物過程靶點-通路圖。

2.4 分子機制網絡分析

構建中藥-靶點-通路的網絡圖(圖3)發現,膜腎協定方在防治IMN的過程中通過多靶點、多通路發揮作用。膜腎協定方主要通過神經活性配體-受體相互作用信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路發揮治療IMN的作用。

圖3 膜腎協定方分子調控網絡圖深綠色正方形代表膜腎協定方中的藥物,淺綠色代表靶點,藍色三角形代表的關鍵通路。

3 討 論

IMN歸屬于“水腫”“尿濁”“慢腎風”等疾病范疇,發病多以脾腎虧虛為本,濕熱瘀血為標[4-5]。膜腎協定方由桂枝、茯苓、防己、黃芪、蒼術、白術、柴胡、黃芩、黨參、升麻、三棱、莪術組成。全方通用,共奏健脾滲濕、活血化瘀之用。本研究通過多數據庫整合篩選了膜腎協定方中治療IMN的34個活性成分。其中,黃芩素可以改善IMN患者高血脂和高血糖狀態。有研究表明,黃芩素可以降低IMN患者血液膽固醇及低密度脂蛋白的含量,增強糖耐量,減少胰島素抵抗,達到降脂降糖的效果[9]。山奈酚可以降低血管炎癥反應,預防血管粥樣硬化的發生[10-11]。谷甾醇可通過降低組胺所誘導的小鼠毛細血管通透性,抑制核因子-κB通路,提高白細胞介素-10活性,降低PEG2、緩激肽、組胺等炎癥介質活性,從而起到緩解IMN患者炎癥反應的作用[12-13]。異鼠李素也具有保護腎功能的作用[14]。膜腎協定方中的34個活性成分主要發揮了降糖、抗炎、降低毛細血管通透性等藥理學作用。研究發現,益氣健脾燥濕類中藥具有降糖、抗炎的藥理學作用[15-17]。而活血類、破血類中藥具有調節血管通透性的藥理學作用[18]。膜腎協定方主治與活性成分的藥理學作用不謀而和。

本研究發現,MAPK、TNF、IL-6、TGF-β1、AKT1、PIK3CA、JUN等148個靶點是模型中的核心靶點。Baranova等[19]研究發現,NOS通過激活p38MAPK抑制脂多糖信號通路,防治循環系統中脂多糖增加的慢性腎炎。Lee等[20]臨床實驗表明,AKT與IκB通過PI3K/AKT通路解離后變為活性狀態,轉位進入細胞核,進而結合核內的κB位點,再進一步調控下游的靶基因表達,從而參與腎臟炎癥、腎臟纖維化以及細胞凋亡等病理過程[21]。Yao等[22]研究發現,TGF-β1被激活后,會通過Smad信號通路發揮其生物學和病理學活性,Smad信號轉導通路介導TGF-β1誘導的膠原合成,并在IMN的發生發展中起著至關重要的作用[23]。張倩等[24]研究發現,高糖上調系膜細胞TGF-β1基因表達激活,使調控區去甲基化,參與腎病的發展。全墨緣等[25]發現,上調p38MAPK能夠改善適應性和固有免疫細胞等多種細胞參與免疫炎性損傷,調節IMN的發展過程。Liu等[26]細胞實驗證明,下調VEGFA表達能夠抑制TGF-β1/Smad3信號轉導腎小管上皮細胞纖維化。因此,膜腎協定方的148個核心靶點可能通過調節纖維化過程、免疫過程、細胞凋亡等過程發揮防治IMN的作用。

KEGG通路富集分析發現,神經活性配體-受體相互作用、信號通路、磷脂酶D信號通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路是膜腎協定方發揮治療IMN作用的主要通路。其中,通過Hepatitis B通路增加發生胰島素抵抗的風險,導致胰島β細胞凋亡,增加了腎纖維化風險[27];通過AGE-RAGE信號通路使肝糖原儲存增加,出現脂質代謝異常,增加血漿中IL-6產生,增加IMN復發的風險[28];通過FoxO信號通路導致氧化應激,使NF-κB信號通路受損導致IMN的發生;通過cAMP信號通路使cAMP表達水平異常促進成纖維細胞的增殖,增加AngII/TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉變及膠原的合成,增加細胞外基質沉積,增加腎纖維化的風險[29]。因此,膜腎協定方的核心通路可能通過調節肝糖原儲存、胰島素抵抗、氧化應激、細胞外基質的沉積等過程發揮防治IMN的作用。

綜上所述,膜腎協定方發揮治療作用主要體現在以下兩方面:①膜腎協定方通過Hepatitis B、AGE-RAGE等通路上調JAK3、MAPK8、MAPK14、MAPK11等靶點的表達,抑制胰島β細胞凋亡,降低了腎纖維化風險;②膜腎協定方通過FoxO信號通路、NF-κB、cAMP信號通路等上調TGF-β1、PIK3CA、PIK3CB、EGFR的表達,調節促纖維化因子、活性氧累積和全身炎癥,降低腎損傷和IMN發生的可能性。本研究進一步闡明了膜腎協定方的物質基礎及關鍵靶點群,并系統地揭示了膜腎協定方治療IMN的網絡作用機理,為IMN的診療手段提供新策略。