miR-451a對慢性心衰細胞模型心肌細胞H9c2凋亡與自噬的影響

朱繼榮, 楊波, 張博媛

深圳市第二人民醫院心內科,廣東深圳 518000

慢性心力衰竭簡稱慢性心衰,主要因為心肌梗死、心肌病、血流動力學負荷過重等引起的心肌損傷[1]。心肌損傷機制復雜多樣,心肌細胞凋亡、自噬在慢性心衰發展過程中具有重要作用[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)在人體不同組織、不同病理或生理過程中表達不同。miRNA異常表達與心肌細胞損傷有關,通過調控相關信號通路參與疾病的發展[3]。研究發現,慢性心衰患者血清miR-451a低表達與患者分級有關[4],但是對慢性心衰細胞模型的研究尚不清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路在心肌細胞損傷中激活能力降低,因此,抑制mTOR信號通路可促進心肌細胞凋亡和自噬[5-6]。本研究通過構建慢性心衰細胞模型,探究miR-451a對心肌細胞凋亡和自噬的影響,以及可能相關的信號通路。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑

大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學院上海細胞庫;DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司;阿霉素(doxorubicin,DOX)、CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;Lipofectamine 2000試劑盒購自賽默飛世爾公司;miR-NC、miR-451a、引物由廣州銳博公司設計合成;TRIzol試劑盒、miScript逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;mTOR通路抑制劑CCI-779購自美國Houston公司;凋亡試劑盒購自碧云天生物公司;剪切的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、Beclin-1抗體、微管相關蛋白1輕鏈3Ⅰ(LC3I)抗體、LC3II抗體、磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體、mTOR抗體、p-p70s6k抗體、p70s6k抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養和模型建立

心肌細胞H9c2用DMEM培養基進行孵育,將細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中。細胞融合超過80%,使用胰蛋白酶消化培養。

取對數期心肌細胞H9c2,胰酶消化處理后,接種至96孔板,在恒溫培養箱中培養24 h后,棄培養基更換新鮮培養基,將細胞分為Control組、DOX組、DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組、DOX+miR-451a+CCI-779組。Control組為正常心肌細胞H9c2;DOX組采用1 μmol/L DOX處理細胞24 h,參照文獻[7]建立慢性心衰細胞模型;DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組為成功轉染miR-NC、miR-451a 6 h后,更換新鮮培養基用1 μmol/L DOX處理細胞24 h;DOX+miR-451a+CCI-779組成功轉染miR-451a 6 h后,更換新鮮培養基用1 μmol/L DOX和mTOR通路抑制劑CCI-779處理細胞24 h。細胞轉染時參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書。

1.3 qRT-PCR檢測miR-451a相對表達水平

取Control組、DOX組、DOX+miR-NC組、DOX+miR-451a組心肌細胞H9c2按照TRIzol法提取細胞總RNA,分光光度計檢測RNA水平,以miScript逆轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA模板,配置熒光定量反應體系進行PCR反應。2-ΔΔCt方法檢測miR-451a相對表達水平,U6作為內參基因。miR-451a上游引物;5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′,下游引物:5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′;U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖活性

收集心肌細胞H9c2,按照1.2進行處理接種96孔板內,繼續培養48 h,每孔中加入100 μL CCK-8溶液,繼續培養4 h,酶標儀檢測450 nm處光密度(optical density,OD)值,細胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集培養24 h的各組心肌細胞H9c2,PBS沖洗細胞,然后制細胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC和PI溶液,避光反應15 min,置于流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.6 Western blotting檢測

使用蛋白裂解液提取心肌H9c2細胞蛋白,BCA法檢測蛋白水平,將30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離,90 V電壓轉膜,封閉培養60 min,將cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3I、LC3II、p-mTOR、mTOR、p-p70s6k、p70s6k抗體稀釋為1∶600,4 ℃過夜孵育,室溫下加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液,孵育60 min,ECL顯色,曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 成功建立慢性心衰細胞模型

光鏡下觀察到正常H9c2細胞為梭形,結構完整,DOX處理后H9c2細胞呈圓梭形,細胞間連接減少,偽足消失,并伴有不同程度的細胞腫脹和壞死,提示慢性心衰細胞模型構建成功(圖1)。

圖1 DOX處理后H9c2細胞形態變化A為正常H9c2細胞;B為1 μmol/L DOX處理24 h的H9c2細胞。

2.2 各組miR-451a表達水平比較

與Control組比較,DOX組miR-451a相對表達水平顯著降低(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組miR-451a相對表達水平顯著升高(P<0.05;圖2)。

圖2 轉染miR-451a在細胞中的表達a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.3 上調miR-451a對DOX誘導H9c2心肌細胞凋亡的影響

與Control組比較,DOX組細胞活性顯著降低,凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組細胞活性顯著升高,凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05;圖3)。

圖3 上調miR-451a對阿霉素誘導H9c2心肌細胞凋亡的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。A為細胞凋亡;B為細胞活性;C為凋亡相關蛋白表達。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.4 上調miR-451a對DOX誘導H9c2心肌細胞自噬的影響

與Control組比較,DOX組Beclin-1、LC3II/I蛋白表達顯著升高(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組Beclin-1、LC3II/I蛋白表達顯著降低(P<0.05;圖4)。

圖4 上調miR-451a對阿霉素誘導H9c2心肌細胞自噬的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.5 上調miR-451a對DOX誘導H9c2心肌細胞相關通路蛋白表達的影響

與Control組比較,DOX組p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達顯著降低(P<0.05);與DOX+miR-NC組比較,DOX+miR-451a組p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達顯著升高(P<0.05;圖5)。

圖5 上調miR-451a對DOX誘導H9c2心肌細胞相關通路蛋白表達的影響1為Control組;2為DOX組;3為DOX+miR-NC組;4為DOX+miR-451a組。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與DOX+miR-NC組比較。

2.6 miR-451a通過調控mTOR信號通路對DOX誘導H9c2心肌細胞凋亡、自噬的影響

與DOX+miR-451a組比較,DOX+miR-451a+CCI-779組細胞活性降低,而凋亡率、cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表達升高(P<0.05;圖6、表1)。

圖6 miR-451a通過調控mTOR信號通路對DOX誘導H9c2心肌細胞凋亡、自噬相關蛋白的影響1為DOX+miR-451a組;2為DOX+miR-451a+CCI-779組。

3 討 論

阿霉素是常見的抗腫瘤藥物,常用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌等惡行腫瘤的治療,但阿霉素也具有明顯的心臟毒性,可誘發慢性心衰[8-9]。多數動物體內實驗、體外細胞實驗常用阿霉素誘導建立慢性心衰模型[10-11]。阿霉素誘導心肌細胞,導致心肌細胞發生氧化應激反應,促進細胞凋亡和自噬,導致心肌細胞嚴重損傷從而誘發慢性心衰[12]。cleaved在正常條件下以無活性的酶原形式存在,外界刺激后以活化酶切的形式存在,常見成員有cleaved-Caspase-3等,Bax促進線粒體膜通透性轉變,使細胞色素C釋放進入細胞質,可激活cleaved-Caspase-3,并促進細胞凋亡[13]。Beclin-1是自噬相關蛋白,與自噬體的形成和成熟形成有關,自噬發生時,LC3I經過剪切與磷脂酰乙醇胺結合后生成LC3II,LC3II/I比值常用來反饋自噬水平[14]。本研究使用阿霉素誘導心肌細胞建立慢性心衰模型,結果顯示,細胞活性降低,凋亡率增加,cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I蛋白表達上調,提示慢性心衰細胞模型構建成功。

miRNA與人類疾病發展有關,還可成為一些疾病分子靶向的靶點[15]。miR-451a通過基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)-2/MMP-9調節心臟重塑的發展[16]。在阿霉素誘導小鼠建立心臟毒性模型的結果顯示,在小鼠模型血漿和組織內miR-34a-5p和miR-451a低表達,表明miR-34a-5p和miR-451a與阿霉素誘導心臟毒性有關[17]。本研究結果顯示,阿霉素誘導心肌細胞中miR-451a表達下調,上調miR-451a可增加細胞活性,降低凋亡率,下調cleaved-Caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3II/I,提示上調miR-451a可減輕阿霉素誘導心肌細胞凋亡和自噬。

miRNA可通過調控信號通路轉導途徑參與疾病的發展[18]。本研究中,上調miR-451a可增加阿霉素誘導心肌細胞中p-mTOR、p-p70s6k蛋白表達。mTOR信號通路有上游信號分子、下游信號蛋白以及mTOR復合體構成,p70s6k是mTOR信號通路底物,mTOR信號通路與心臟疾病發生密切相關[19]。研究表明,mTOR信號通路在阿霉素誘導的心肌細胞中表達降低,通過激活信號轉導途徑參與心肌損傷[20]。本研究結果顯示,加入mTOR信號通路抑制劑逆轉了上調miR-451a對阿霉素誘導心肌細胞凋亡和自噬的影響,提示miR-451a通過調控mTOR信號通路影響阿霉素誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述,上調miR-451a可抑制阿霉素誘導心肌細胞凋亡和自噬,其作用機制可能與mTOR信號通路有關。