沉默lncRNA NEAT1通過抑制NF-κB通路減輕LPS 誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應

王靜, 邵小美, 盛娜, 楊震

南京江北醫院 1.呼吸與危重癥科,2.呼吸科,江蘇南京 210000

人支氣管上皮(human bronchial epithelium,HBE)在維持呼吸系統穩態方面發揮重要作用[1]。炎癥細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等在多種刺激下均可在HBE細胞中上調[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與多種生理和病理過程,包括炎癥反應。在膿毒癥中,抑制lncRNA NEAT1的表達可阻礙膿毒癥的發展和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的細胞損傷及炎癥反應[3]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)與細胞炎癥反應密切相關[4]。香煙煙霧提取物通過激活16HBE細胞中NF-κB通路促進細胞的氧化應激和炎癥反應[5]。本文采用LPS建立氣道炎癥模型,分析lncRNA NEAT1在LPS誘導的HBE細胞炎癥中的作用以及NF-κB信號通路所發揮的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人16HBE細胞購于深圳Otwo Biotech公司。胎牛血清購于蘭州榮曄生物科技有限責任公司;DEME培養基、胰蛋白酶購于上海聯邁生物工程有限公司;LPS購于上海碧云天生物技術有限公司;Lipofectamine? 2000轉染試劑、SuperScript反轉錄試劑盒購于美國英杰生命技術有限公司;Total RNA提取試劑盒購于福州飛凈生物科技有限公司;SYBR Green qPCR Master Mix購于美國Med Chem Express(MCE)生物科技公司;人IL-1β、IL-6及TNF-α的ELISA試劑盒均購于武漢菲恩生物科技有限公司;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物購于上海雅吉生物科技有限公司;RIPA裂解緩沖液購于美國AMRESCO公司;一抗PCNA、p53、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化-IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65、p-NF-κB p65及內參α-tubulin均購于英國Abcam公司;異硫氰酸熒光素標記IgG(FITC-IgG)購于上海阿拉丁試劑有限公司;引物及針對lncRNA NEAT1特定的小干擾RNA(si-NEAT1)及siRNA干擾對照(si-NC)均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。Applied Biosystems ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統公司;Multlskan Mk3酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司;BD Accuri?C6流式細胞儀購自美國BD公司;FV1000激光共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.2 細胞培養及分組

采用含10%胎牛血清的DEME培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養16HBE細胞,待其生長鋪滿培養皿85%時,去除培養基,使用PBS清洗后添加胰蛋白酶消化,顯微鏡觀察到細胞回縮,間隙變大后終止消化,去除消化液后添加新的培養基,按照1∶3的比例進行傳代培養。選取培養的16HBE細胞接種于6孔細胞培養板中(1×106個/孔),當細胞生長至培養板75%時,向每孔中添加50 mg/L LPS[6],再繼續將培養板置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h,收集細胞進行后續研究。

16HBE細胞分為Control組(等體積生理鹽水培養)、LPS組(50 mg/L LPS處理24 h)、LPS+si-NC組(si-NC轉染24 h后添加50 mg/L LPS處理24 h)和LPS+si-NEAT1組(si-NEAT1轉染24 h后添加50 mg/L LPS處理24 h)。參照Lipofectamine?2000轉染試劑盒說明書進行瞬時轉染。

1.3 lncRNA NEAT1及炎癥細胞因子水平檢測

使用Total RNA提取試劑盒依次從各組培養的16HBE細胞中提取總RNA,使用SuperScript反轉錄試劑盒進行反轉錄,隨后使用SYBR Green qPCR Master Mix配制反應體系在熒光定量PCR儀中對mRNA進行定量分析。以β-actin為內參,2-ΔΔCt法計算。實時熒光定量PCR反應程序:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個循環。ELISA法檢測各組細胞培養液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量,所有操作流程均根據試劑盒說明書進行。

lncRNA NEAT1:F-5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3′,R-5′-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3′;IL-6:F-5′-CCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3′,R-5′-CGTCGAGGATGTACCGAATTT-3′;IL-1β:F-5′-CTCTCACCTCTCCTACTCACTT-3′,R-5′-TCAGAATGTGGGAGCGAATG-3′;TNF-α:F-5′-GGATGGATGGAGGTGAAAGTAG-3′,R-5′-TGATCCTGAAGAGGAGAGAGAA-3′;β-actin:F-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′,R-5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活力

取各組16HBE細胞,以2×103個/孔接種于96孔培養板中培養24 h后,向每孔中添加100 μL DEME培養基(含10% MTT溶液)后置于培養箱中繼續培養4 h,添加100 μL Formanzan溶解液繼續培養細胞約4 h,直至觀察Formazan被完全溶解,使用37 ℃預熱的酶標儀于570 nm處讀取各孔光密度值(OD)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取各組16HBE細胞,以1×106個/孔接種于6孔培養板中,培養24 h,去除上清,收集細胞,使用培養基稀釋細胞為1×105個/mL,添加200 μL 1×Binding buffer懸浮細胞后添加5 μL Annexin V-FITC和PI,在室溫避光孵育15 min,添加300 μL 1×Binding buffer,混勻后于流式細胞儀中分析各組細胞凋亡率。

1.6 Western blotting檢測

將各組16HBE細胞在含1%蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中冰上裂解30 min,裂解后離心10 min,收集上清液,98 ℃變性5 min。將獲得的總蛋白通過10% SDS-PAGE電泳分離,將蛋白轉移到PVDF膜上。添加5%脫脂牛奶封閉2 h,將膜與相對應的一抗(PCNA、p53、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65及α-tubulin)4 ℃下孵育過夜,隔天將膜與二抗IgG-H&L(1∶2 000)孵育2 h。ECL化學發光檢測試劑盒對蛋白質印跡條帶進行可視化,Image J分析條帶灰度值。最終目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.7 免疫熒光技術檢測細胞NF-κB p65定位

取各組5×104個/μL細胞添加在12孔板的載玻片上。PBS沖洗3次,室溫下用4%多聚甲醛固定10 min,添加抗體p-NF-κB p65孵育細胞。PBS洗滌后,加入FITC-IgG。最后,對載玻片進行沖洗、安裝,在激光共聚焦顯微鏡(488 nm)上進行觀察拍照,并通過熒光定量進行細胞核和細胞質中NF-κB p65的比率分析。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件分析。使用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導的16HBE細胞炎癥因子的影響

與Control組比較,LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α及其mRNA、lncRNA NEAT1表達水平顯著上調(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組上述指標表達水平顯著下調(P<0.05;表1)。

表1 各組16HBE細胞中lncRNA NEAT1及IL-1β、IL-6及TNF-α水平及其mRNA相對表達量

2.2 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導的16HBE細胞增殖及凋亡的影響

與Control組比較,LPS組16HBE細胞增殖活力及PCNA表達水平均明顯降低,凋亡率及p53表達水平明顯升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組16HBE細胞增殖活力及PCNA表達水平均明顯升高,凋亡率及p53表達水平明顯降低(P<0.05;圖1)。

圖1 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導的16HBE細胞增殖、凋亡的影響A為MTT法檢測細胞活力;B、C為Western blotting檢測蛋白水平及柱狀圖;D、E為流式細胞儀檢測細胞凋亡及柱狀圖。a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與LPS+si-NC組比較。

2.3 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導的16HBE細胞中NF-κB通路相關蛋白的影響

與Control組比較,LPS組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05;圖2)。

圖2 Western blotting檢測IκBα、p-IκBα、NF-κB p65與p-NF-κB p65蛋白水平a為P<0.05,與Control組比較;b為P<0.05,與LPS+si-NC組比較。

2.4 沉默lncRNA NEAT1對LPS誘導的16HBE細胞中NF-κB p65定位的影響

與Control組比較,LPS組16HBE細胞中p-NF-κB p65相對熒光強度(細胞核/細胞質)升高(P<0.05);與LPS+si-NC組比較,LPS+si-NEAT1組細胞中p-NF-κB p65相對熒光強度降低(P<0.05;圖3)。

圖3 免疫熒光技術測定p-NF-κB p65在16HBE細胞中的表達(100×)

3 討 論

LPS刺激引起的炎癥反應會產生大量炎癥細胞因子,進一步誘發細胞凋亡和損傷[7]。本研究結果顯示,LPS上調16HBE細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及其mRNA表達水平。IL-1β作為免疫反應的放大器,其過量產生可引起自身炎癥,也廣泛參與細胞的炎癥反應[8-9];TNF-α屬于TNF家族,是主要的促炎細胞因子[10]。本研究結果顯示,LPS抑制16HBE細胞增殖活力及PCNA蛋白水平,并上調凋亡率和p53蛋白水平。PCNA是一種必不可少的蛋白質,參與各種DNA代謝過程,可作為細胞增殖的重要指標[11];而p53是一種轉錄因子,可通過調控多個基因轉錄激活促進細胞凋亡[12]。

lncRNA是許多生物事件發展的重要調節因子,可廣泛參與細胞內多種生物過程的發生發展[13]。lncRNA NEAT1廣泛存在哺乳動物的細胞中,參與多種疾病炎癥反應[14-15]。但lncRNA NEAT1在HBE細胞炎癥反應中的調控機制尚未可知。本研究結果顯示,沉默lncRNA NEAT1可降低LPS誘導的16HBE細胞增殖活力。Gao等[4]發現,lncRNA NEAT1可促進腎小管內皮細胞中LPS誘導的細胞炎癥損傷。本研究結果提示,沉默lncRNA NEAT1可明顯抑制LPS誘導的16HBE的炎癥細胞因子合成與釋放及細胞凋亡,并促進細胞增殖。

本研究結果顯示,LPS處理后16HBE細胞中p-IκBα與p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高。據以往報道顯示,NF-κB信號通路是炎癥反應調節因子[16-17]。NF-κB信號通路被激活時,最終引起NF-κB從細胞質NF-κB/IκBα復合體中釋放出來,細胞質NF-κB迅速轉移到細胞核中并啟動靶基因表達[18-19]。以上數據提示,LPS處理激活了IκBα和NF-κB p65的磷酸化和細胞質中p-NF-κB p65向細胞核中轉移,表明LPS可能通過激活NF-κB信號通路誘導16HBE細胞炎癥反應。沉默lncRNA NEAT1可明顯逆轉LPS對16HBE細胞中NF-κB信號通路的激活作用。沉默lncRNA NEAT1可抑制IκBα和NF-κB p65的磷酸化和細胞質中的p-NF-κB p65向細胞核中轉移,進而對LPS誘導的16HBE細胞的炎癥反應發揮抑制作用。

綜上所述,沉默lncRNA NEAT1可通過抑制NF-κB通路激活進而減輕LPS誘導16HBE細胞的炎癥反應。