空腹血清果糖暴露對老年人群骨代謝細胞因子的影響

蘇威武, 劉效成, 覃心如, 王穆,

1.長沙市岳麓區(qū)疾病預(yù)防控制中心,湖南長沙 410013;2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院臨床研究所,湖南衡陽 421002;3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南衡陽 421001

自1967年引入高果糖玉米糖漿(high fructose corn syrup,HFCS)以來,果糖的消費量迅速增加[1-5]。果糖攝入對骨骼健康的影響日益受到重視[6-8]。但目前在人群水平上的研究甚少。本研究應(yīng)用流式細胞儀檢測了老年果糖暴露人群和非暴露對照人群血清13種骨代謝細胞因子的含量,包括骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、血小板衍生因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、肝/骨/腎堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)、抗酒石酸酸性磷酸酶5(tartaric acid resistant acid phosphatase 5,ACP5)、瘦素(leptin)、核因子-κB受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、IL-1β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和dickkopf WNT信號通路抑制劑-1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1,DKK-1),并分析兩組人群中這些骨代謝相關(guān)細胞因子的差異,以期為老年人群骨代謝相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

骨代謝流式多因子檢測試劑盒購自美國LEGENDplexTM公司(Cat.No.741360);果糖檢測試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司(Cat.No.G20221010H);雙激光6色流式細胞儀購自深圳市達科為生物技術(shù)股份有限公司(型號:EXFLOW-206-0016)。

1.2 人群的選擇

課題組前期對湖南省衡陽市某社區(qū)約2 000人空腹血清進行了果糖檢測。從中隨機抽取37名果糖高暴露老年人及37名未檢出血清果糖且嚴(yán)格匹配年齡和性別的老年人為本研究的對象,并檢測兩組研究對象血清13個骨代謝細胞因子的含量。所有研究對象均填寫了知情同意書。本研究方案經(jīng)南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號2022-KY-167)。所有試驗根據(jù)《赫爾辛基宣言》或其他相關(guān)指南和法規(guī)的原則進行。

1.3 血清果糖檢測

采用微板法檢測晨起空腹血清果糖質(zhì)量濃度。主要原理:果糖經(jīng)特異性酶的作用后轉(zhuǎn)化為葡糖糖,葡萄糖在己糖激酶等酶復(fù)合物的作用下,使還原型輔酶Ⅱ的量不斷增加,用酶標(biāo)儀檢測340 nm下該物質(zhì)的增加量,進而計算得到果糖質(zhì)量濃度。

1.4 血清骨代謝細胞因子檢測

首先將預(yù)混合珠瓶在超聲儀浴中超聲處理1 min,并在渦旋中超聲處理30 s;將20×洗滌緩沖液加熱至室溫,混勻使所有鹽溶解;用475 mL去離子水稀釋25 mL 20×洗滌緩沖液,未使用的部分儲存在2～8 ℃,最長可儲存1個月。添加5.0 mL LEGENDplexTM測定緩沖液至裝有凍干Matrix A的瓶子中,渦旋≥15 min以使其完全溶解,剩余的Matrix A在≤-70 ℃下保存不能超過1個月。取50 μL空腹血清樣本加入50 μL測試緩沖液,將所有試劑放至室溫后加入“V”形底板。流式細胞儀主要設(shè)置參數(shù)為報告通道FL2;通道發(fā)射激光575 nm;分類通道FL4;通道發(fā)射激光660 nm。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析。正態(tài)分布資料采用兩樣本均數(shù)t檢驗,非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗;兩樣本率的比較采用卡方檢驗;果糖與骨代謝相關(guān)細胞因子間的關(guān)聯(lián)關(guān)系采用多變量Logistics回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 果糖暴露與非暴露人群的一般資料比較

與未檢出血清果糖的人群相比,果糖暴露人群高密度脂蛋白顯著降低、心率顯著升高(P<0.05;表1)。

表1 果糖暴露與非暴露人群一般資料比較(n=37)

2.2 13種骨代謝相關(guān)細胞因子水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況

如圖1所示,空腹血清13種骨代謝細胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好(R2>0.99),其中,OPG、OPN、PDGF-BB、ALPL、ACP5、leptin、PTH、DKK-1等因子的擬合曲線的R2>0.999。

圖1 13種骨代謝相關(guān)細胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況

2.3 果糖高暴露老年人群與對照人群血清骨代謝細胞因子的水平差異分析

與未檢出血清果糖的人群相比,果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6、DKK-1等細胞因子顯著升高(P<0.05;表2),其中,OPN增加最顯著,增加2.39倍。

表2 果糖暴露對空腹血清骨代謝細胞因子的影響(n=37) ng/L

2.4 老年人群果糖暴露與血清骨代謝細胞因子的關(guān)聯(lián)關(guān)系分析

采用Logistic回歸模型分析了空腹血清果糖與骨代謝細胞因子之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)血清果糖與上述13個骨代謝細胞因子之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表3)。

表3 血清果糖對骨代謝細胞因子影響的OR值和95%置信區(qū)間

3 討 論

隨著年齡的增加,骨骼疾病的發(fā)病風(fēng)險也隨之增加,絕經(jīng)后女性及老年群體患病風(fēng)險更高。2006年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,中國已經(jīng)有接近7 000萬骨質(zhì)疏松患者及超過2億的骨量減少患者[9]。隨著人口老齡化的加劇,中國骨代謝相關(guān)疾病患者的數(shù)量還將上升。

果糖有兩大代謝特征:首先,果糖顯著增強糖酵解,抑制能量消耗、促進脂肪及糖原的生成;其次,果糖在進入細胞后被快速磷酸化,導(dǎo)致細胞內(nèi)磷酸鹽急劇下降,從而激活一磷酸腺苷脫氨酶-2,促使一磷酸腺苷降解為肌苷酸并最終降解為尿酸[10]。在食物缺乏的條件下,果糖獨特的代謝機制增強了人類祖先的生存能力;但在當(dāng)前普遍能量過剩的情況下,果糖可能增加肥胖、代謝綜合征及高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險[10]。然而,果糖對骨代謝的影響目前還缺乏人群水平的證據(jù)。本研究應(yīng)用小樣本人群探索性分析發(fā)現(xiàn)果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6和DKK-1顯著升高。

成骨細胞表面的RANKL、NF-κB受體的活化因子(RANK)和OPG是破骨細胞發(fā)生和調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵決定因素[11]。在去卵巢大鼠模型中,給予10%的果糖喂食能顯著升高RANKL[12]。本研究在人群水平上并沒有發(fā)現(xiàn)果糖暴露對RANKL和OPG有顯著影響。

IL-6能上調(diào)成骨細胞表面RANKL的表達和加速RANK信號,從而直接導(dǎo)致骨質(zhì)破壞[13]。本研究中,IL-6顯著升高但RANKL沒有明顯變化,表明果糖暴露能增加機體的炎癥水平。成骨細胞、骨細胞及破骨細胞均可分泌OPN,在骨基質(zhì)的礦化和吸收過程中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清OPN顯著升高,其中,伴有骨侵蝕的患者血清OPN更高[14]。OPN在正常細胞和組織中的表達受抑制,只有在炎癥或組織損傷時其表達才增強。果糖暴露導(dǎo)致OPN顯著升高,可能與果糖暴露升高機體炎癥水平有關(guān)系。

DKK-1是dickkopf家族的成員。研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)DKK-1水平顯著升高,且DKK-1的異常表達引起的骨代謝功能障礙參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中病理性骨侵蝕的發(fā)病[15]。本研究結(jié)果顯示,果糖高暴露人群血清DKK-1顯著增高,提示果糖暴露可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有關(guān),但還需進一步的證據(jù)。

ALPL在肝臟、骨骼和腎臟中分布最多,在堿性條件下(pH 8～10)能水解磷酸單酯,從而參與骨骼的礦化過程[16]。果糖暴露人群ALPL水平的升高并不代表果糖暴露能增加骨骼的礦化,還應(yīng)檢測ALPL的活性。

本文結(jié)果顯示,果糖暴露顯著降低高密度脂蛋白、顯著升高心率。高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化及血管保護等生物學(xué)作用[17]。既往一項大型隨機對照研究也報道了果糖暴露與高密度脂蛋白顯著降低有關(guān)[18];在慢性腎病患者中也觀察到果糖能降低高密度脂蛋白[19]。果糖對高密度脂蛋白的降低作用可能與其能加強脂肪生成有關(guān)[10]。在果糖升高心率方面,既往有動物實驗結(jié)果與此一致[20],可能與果糖的血壓保持作用有關(guān)[10]。

本研究應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測了37名高果糖暴露人群和37名對照人群血清骨代謝相關(guān)細胞因子的改變情況,發(fā)現(xiàn)OPN、ALPL、IL-6和DKK-1四種細胞因子與果糖暴露顯著相關(guān)。但所納入的樣本量相對較小,回歸分析的結(jié)果為陰性可能與此有關(guān),后期應(yīng)該在此研究的基礎(chǔ)上開展更大規(guī)模的人群流行病學(xué)研究進行驗證。