基于HS-SPME-GC-MS分析墨蘭不同花器官香氣成分

丁麗瓊　羅清　覃茜　唐毓瑋　呂麗蘭　池昭錦

關鍵詞：墨蘭；花器官；香氣；HS-SPME-GC-MS

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

墨蘭（ Cymbidium sinense ） 為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium Sw.）的地生植物，因其葉形優美、品種豐富、花期恰逢春節而深受消費者歡迎[1]。墨蘭為國蘭代表性種類之一，其花香馥郁、沁人心脾[2]，為優質香料物質，具有很高的經濟價值和觀賞價值[3]。香氣是構成和影響花卉觀賞價值的重要因素，但由于花香的成分、結構及其生物合成過程比較復雜，研究水平滯后于花形、花色等其他觀賞性狀的研究[4]。近年來由于分析技術的進步，對蘭科植物香氣研究逐漸增多。BAEK 等[5]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）對大花蕙蘭新雜交種陽光之鐘盛花期花器官揮發物進行了測定，鑒定出23 種成分，其中柱中鑒定出12種化合物，唇瓣中鑒定出16 種化合物，萼片中鑒定出11 種化合物，花瓣中鑒定出9 種化合物。王元成等[6]采用HS-SPME 結合GC-MS 技術，對5種石斛花朵的揮發性成分進行分析，共鑒定出110個揮發性成分，主要成分為烷類、烯類、醇類、酮類等，且不同石斛花朵的芳香成分不盡相同。晉宇軒等[7]采用SPMG 結合GC-MS 技術對貴州春蘭的花苞和花朵進行檢測，結果檢測出揮發性成分分別為43 種和47 種，花苞中烴類含量最高，花朵中萜烯類的含量最高，橙花叔醇為主要花香成分。楊慧君等[8]采用SPME-GC-MS 聯用技術分析小桃紅花香成分，共鑒定出揮發性成分35 種，酯類物質含量最多，主要花香成分為茉莉酸甲酯、茉莉酮酸甲酯和金合歡醇。許紅娟等[9]采用頂空固相萃取法結合氣相色譜和質譜對蕙蘭守良梅花朵各部位（蕊柱、唇瓣、棒瓣、主瓣和副瓣）進行香氣成分檢測，結果發現蕙蘭守良梅花朵蕊柱的主要香氣成分有7 類23 種，花朵5 個部位的醇類芳香物質相對含量較高。魏丹等[10] 采用HS-SPME-GC-MS 聯用分析3 種蘭花鮮花的香氣成分，結果發現蕙蘭鮮花的主要花香成分為桉油精、（E）-4-己基葵烯-6-炔等，墨蘭鮮花的主要花香成分為甲基-異丁子香酚、6-氧代庚酸甲酯等，春蘭鮮花的主要花香成分為α-芹子烯、十二烷等。目前未見墨蘭不同花器官的揮發性物質成分的相關研究報道。鑒于此，本研究以墨蘭為材料，基于HS-SPME-GC-MS 技術探索墨蘭不同花器官的花香成分的差異，以期為培育香型蘭花新品種奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的材料為廣西亞熱帶作物研究所蘭花種質資源圃培育多年生的墨蘭植株。在1 月份晴天10：00—11：00 選取開放第4 天盛花期的墨蘭花朵（圖1），取萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱4個部分各1 g（重復3 次），用于香氣成分測定，使用頂空固相微萃取方法萃取樣品中的香氣成分。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將新鮮花朵的不同器官樣品加一級水混勻至50 mL 離心管中，分別取5 mL待測樣品、1.00 g 氯化鈉和10 μL 內標（4-甲基-2-戊醇，1.0018 g/L）置于20 mL 樣品瓶中，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，移至加熱和攪拌裝置中，在40 ℃下加熱攪拌30 min，攪拌速度為500 r/min。

1.2.2 頂空固相微萃取（HS-SPME） 使用SPME萃取頭（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS， Supelco，Bellefonte， PA.， USA）與CTC CombiPAL 自動進樣器（CTC Analytics， Zwingen， Switzerland）相連進行自動化的頂空固相微萃取。經過前處理的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱分別取1 g 放入萃取瓶中，萼片、花瓣及唇瓣分別置于1 L 的萃取瓶中，蕊柱分別置于60 mL 萃取瓶中，50 ℃平衡10 min后，將已活化SPME 萃取頭插入萃取瓶的頂空部分，萃取30 min。之后取出SPME 萃取頭，立即插入GC 進樣口在250 ℃條件下解析8 min。

1.2.3 氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）條件 采用Agilent 6890 氣相色譜儀與Agilent 5975 質譜儀相連，色譜柱采用HP-Innowax 毛細管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm，J&W Scientific，Folsom，CA）分離鑒定芳香揮發物。

氣相色譜條件：載氣（He）流速為1 mL/min；采用不分流模式自動進樣，升溫程序為50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min 升溫至220 ℃，保持5 min。

質譜條件：質譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為EI，電離能為70 ev，質譜掃描范圍為m/z 29-350。

1.2.4 香氣物質定性與定量分析方法 （1）定性分析。利用自動化質譜圖解卷積和鑒定軟件（AMDIS）計算保留指數（retention index， RI）和質譜圖信息。其中，有標準品的目標組分，與標準品的出峰時間和質譜譜圖比較定性；沒有標準品的目標組分，通過保留指數與NIST11 標準譜庫的RI 和質譜譜圖比對進行定性分析。化合物的保留指數是通過分析相同色譜條件下C6-C24正烷烴保留指數計算得到。具體公式如下：

式中，I 為保留指數，t，t，t分別代表組分及碳數為n，n+1 正構烷烴的保留時間。

（2）定量分析。配置1 L 含7 g/L 酒石酸和200 g/L 模擬水溶液，并用NaOH 調pH 至3.4。將溶解在乙醇（色譜級）的所有標準品溶液混合，并將混合液用模擬水溶液稀釋成連續的15 個濃度水平。在與樣品相同的條件下，提取并分析每個濃度水平的香氣標準曲線。通過建立香氣物質標準曲線（橫坐標：香氣化合物標準品與內標4-甲基-2-戊醇的峰面積比，縱坐標：該香氣化合物標樣的濃度），對相關香氣化合物進行定量分析。除此之外，其他沒有標準曲線的化合物通過相似結構的化合物或者碳原子數相似的化合物的標準曲線進行定量分析[11]。相對含量為組分峰面積占總峰面積的百分比[12]。

1.3 數據處理

各組分質譜經計算機譜庫檢索及資料分析并結合人工譜圖解析，確認各個化學成分。使用Origin 8.0 軟件對數據進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 墨蘭不同花器官揮發化合物組成

經過GC-MC 分析，從墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發性成分，主要由21 種醛類、12 種醇類、10 種酮類、5 種苯類、2 種呋喃類、2種酸類和2 種萜類化合物組成，其中醛類含量最高（圖2）。在不同器官中各種主要成分的含量不同，在萼片中醇類較其他3 個器官少，而酸類則較其他器官多1 種，花瓣及唇瓣中醛類較其他器官少1種，萼片及唇瓣中酮類較其他器官少。

在不同花器官中，墨蘭花的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱檢測出的香氣成分分別有49、51、48 和51 種。蕊柱及花瓣香氣的組成成分最多，其次是萼片，唇瓣較少。不同花器官揮發成分見表1。由圖3 可知，4 種組織均含有的化合物有48 種，包括19 種醛類（苯甲醛、2，4，-二甲基苯甲醛、丙醛、異戊醛、戊醛、巴豆醛、己醛、E-2-戊烯醛、庚醛、青葉醛、環戊基甲醛、（Z）-4-庚烯醛、E-2-庚烯醛、壬醛、（E，E）-2，4-己二烯醛 、E-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、鳶尾醛、2，4-辛二烯醛）；10 種醇類（甲醇、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇、1-己醇、Z-3-己烯醇、蘑菇醇、2-丙基-1-戊醇、2-乙基己醇、E-2-辛烯醇、苯甲醇）；9 種酮類（甲基異丁酮、1-戊烯-3-酮、2-庚酮、環己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、2，2，6-三甲基環己酮、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、異佛爾酮）；5 種苯類（甲苯、對乙基甲苯、1-乙基-2，4-二乙基苯、M-異丙基甲苯、1-溴萘）；2 種萜類（茶螺烷、2，4-二叔丁基苯酚）；2 種呋喃類（2-乙基呋喃、2-戊基呋喃）；1 種酸類為己酸。花瓣、萼片及蕊柱共有成分3 種（2，3-戊二酮、桉葉油醇、丙炔醇）。只在萼片中檢測到有2 種（2-甲基-4-戊醛和戊酸），丙烯醛只在蕊柱檢測出。

萼片中檢測出的香氣成分數量中等但物質含量最高，達99 106.15 μg/L，占總揮發性有機成分的35.88%。花瓣及蕊柱檢測出的香氣成分數量比萼片多2 種，物質含量分別為56 571.48、78 868.68μg/L， 分別占總揮發性有機成分的20.48%和28.56%。唇瓣中檢測出的香氣成分數量最少，物質含量也最少，為41 645.32 μg/L，占總揮發性有機成分的15.08%。因此，墨蘭不同花器官香氣成分及其含量存在差異，萼片揮發性物質含量最高與感官上的初步判斷一致。

在準確定量的化合物中，醛類化合物含量最高，為239 760.71 μg/L；其次是醇類化合物為34 864.05 μg/L，苯類化合物為940.50 μg/L，酸類化合物為456.53 μg/L，酮類化合物為122.91 μg/L，萜類化合物為47.01 μg/L ， 最少的呋喃類為0.15 μg/L。檢測到醛類化合物中含量最高的是環戊基甲醛；醇類化合物中含量最高的是1-戊烯-3-醇；苯類化合物中含量最高的是2，4，-二甲基苯甲醛；酸類化合物中含量最高的是己酸；酮類化合物中含量較高的是甲基庚烯酮；萜類化合物中含量最高的是2，4-二叔丁基苯酚；呋喃類化合物中含量較高的是2-戊基呋喃。

2.2 墨蘭不同花器間香氣成分揮發量的差異

各化合物揮發量在不同器官中存在著明顯差異，且每個器官化合物含量不同（表2）。萼片中有11 種化合物含量均較其他3 個器官含量高，其中環戊基甲醛在萼片中含量最高，為41 248.26 μg/L，其次是花瓣為17 659.45 μg/L，唇瓣及蕊柱含量遠低于萼片，分別比萼片少35 053.29、33 941.80 μg/L，具有薄荷的樟腦味。1-戊烯-3-醇在花瓣中含量最高（4170.67 μg/L），具有水果香味。唇瓣中丙醛、1- 戊烯-3- 酮、E-2- 戊烯醛、E-2- 戊烯-1- 醇、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮等5 種化合物含量均較其他3 個器官含量高，具有水果清香味。蕊柱中有18種化合物含量均較其他3 個器官含量高，其中E-2-庚烯醛在蕊柱中含量高達1 174.91 μg/L，其次是唇瓣552.74 μg/L，在萼片及花瓣中的含量為191.59、160.43 μg/L，具有青草香和油脂香。

2.3 不同花器官揮發物主成分分析

為了進一步反應墨蘭不同花器官香氣物質構成的差異，對4 個不同花器官的54 個揮發性物質進行主成分分析。對于不同花器官與揮發性成分之間（圖4），第一主成分（PC1）的貢獻率為61.8%，第二主成分（PC2）的貢獻率為25.8%，前2 個主成分占總方差的87.6%，能夠很好的保留樣本原來的信息。4 種花器官中唇瓣和花瓣位于同一象限，表明差異性小。蕊柱單獨在PC1、PC2 負方向上，說明與其他器官差異性大。萼片單獨在PC1正方向、PC2 負方向上，也與其他器官差異性大。戊醛（4）、己醛（6）、E-2-戊烯醛（7）、E-2-己烯醛（10）、環戊基甲醛（11）、E-2-庚烯醛（13）、1-戊烯-3-醇（23）、E-2-戊烯-1-醇（25）在PC1和 PC2 上的貢獻較高，說明這些成分是花器官香氣釋放的主要揮發性成分。1-戊烯-3-醇（23）在 PC1 的正方向上貢獻最大，與花瓣呈正相關關系，且在花瓣中含量最高。己醛（6）在PC2的負方向上貢獻最大，與蕊柱呈正相關關系，且在蕊柱中含量最高。

3 討論

花香是植物的重要特征[36]，揮發性化合物的數量和類型是影響花香品質的重要指標，也決定了蘭花的商業價值。我國傳統的觀賞蘭花包括春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭、寒蘭和蓮瓣蘭等系列，不同系列不同品種的蘭花香氣成分種類存在異同。不同品種蕙蘭[37]香氣成分主要為萜烯類、醇類、醛類、酯類、酮類、烷烴類和芳香烴，另有少量的酚類、酸類和醚類物質，建蘭品種小桃紅主要香氣成分為酯類[8]，貴州春蘭揮發性成分和花香成分的主要物質是萜烯類[7]，不同花色寒蘭香氣成分主要有醇類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷類和酯類[38]。本研究中墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發性成分，主要由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成，其中醛類含量最高。

花朵不同花器官所含的揮發物及含量差異明顯，不同品種花朵揮發性成分釋放的主要花器官也不同。徐慧等[39]研究表明牡丹不同部位之間的揮發性化合物種類和相對含量存在較大差異，周晨晨等[40]研究表明白蘭地海棠不同花器官的花香成分存在明顯差異，揮發性成分釋放的主要花器官是雌蕊。宋朝偉等[41]研究表明2 個芍藥品種花香成分在不同花器官之間香氣物質的釋放量均呈現出明顯差異，釋放量最高的為瓣化雄蕊，與感官上香氣的初步判斷相吻合。本研究中，墨蘭萼片共檢測出49 種揮發物，物質含量最高，其中含量最高的揮發物為環戊基甲醛，具有薄荷的樟腦味；蕊柱檢測出的揮發物物質含量次之，其含量最高的揮發物為己醛，呈青草香氣；花瓣檢測出揮發物的物質含量第三，其含量最高的揮發物為1-戊烯-3-醇，具有水果香味；唇瓣檢測出揮發物的物質含量最低，其含量最高的揮發物為環戊基甲醛；萼片揮發性物質含量最高與感官上的初步判斷一致，萼片是揮發性成分釋放的主要花器官。通過主成分分析發現，4 種花器官中唇瓣和花瓣差異性小，蕊柱與其他器官差異性大，萼片也與其他器官差異性大。戊醛、己醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、環戊基甲醛、E-2-庚烯醛、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇是4 個花器官香氣釋放的主要揮發性成分，主要呈青草、水果香味。

本研究表明，不同花器官中揮發性香氣成分種類組成相似，由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成。但不同花器官揮發物物質含量不同，48 種共有物質在不同花器官中物質含量存在顯著差異。萼片物質含量最高，因此盛花期墨蘭花朵萼片是揮發性成分釋放的主要花器官。不同花器官的花香成分物質含量存在明顯差異，這為研究香型蘭花新品種選育及香氣形成機制提供參考依據。