基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的沉香2-(2-苯乙基)色酮聚合物成分分析

陽辛鳳　梅文莉　李薇　龐朝海　董文化　潘永波　張群

關鍵詞：沉香；2-（2-苯乙基）色酮聚合物；超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間質譜

中圖分類號：Q949.761.1；R284.1 文獻標識碼：A

沉香（ agarwood ） 是由瑞香科沉香屬（Aquilaria spp.）植物木質部組織及其分泌物共同組成的木材[1-3]，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞、越南、柬埔寨、中國等國家[3-5]。沉香是一種珍稀藥材，具有安神鎮靜、消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤等功效[3， 6-9]。2-（2-苯乙基）色酮聚合物（PPECs）是與沉香藥理活性密切相關的一類重要生物活性物質[3]。根據結構特征，PPECs 分為3 類，由2 個或3 個2-（2-苯乙基）色酮單元結合形成的2-（2-苯乙基）色酮二聚物（DPECs）和2-（2-苯乙基）色酮三聚物（TPECs），以及由萜類與2-（2-苯乙基）色酮單元結合形成的萜類-2-（2-苯乙基）色酮二聚物（SPECs）[3-5]。在已有報道中，氣質聯用技術是對沉香中化學成分進行分析的主要方法，廣泛用于萜類為主的眾多揮發性成分和低分子量2-（2-苯乙基）色酮類成分的鑒定[10-16]。然而沉香中PPECs 分子量較大，沸點高， 不適于氣質聯用分析。目前對沉香PPECs 的分析多沿用傳統的先分離純化后結構鑒定方式[17-20]。據報道，從不同產地、不同品種沉香中分離鑒定的2-（2-苯乙基）色酮類成分約250個，其中PPECs 約100 個[3-5]。近年來，超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS/MS）開始應用于沉香中色酮類成分的鑒定，鑒定了AH12、AH13、AH15、AH21、methoxyAH21、dehydroxy AH21 等PPECs[5， 21-23]。PPECs不僅具有生物活性，而且多樣性豐富，是沉香產地鑒定、結香方式鑒別的重要標志性成分[5， 21-23]，因此有必要深入挖掘沉香PPECs 分子資源。

本研究采用超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對沉香PPECs 成分進行鑒定，有助于深入了解沉香藥材的藥物組成，為沉香藥材的現代化與標準化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 沉香對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試劑 乙腈（色譜純），購自德國默克公司；甲酸（色譜純），購自美國Fisher 公司。超純水為Milli-Q 系統純化水，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜儀：Triple TOF 5600+型，安裝有Analyst?TF 1.6 工作站、PeakView? 2.0 軟件，美國ABSCIEX 公司；電子天平：ME204 型，感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；電子天平：JJ500 型，感量0.01 g，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 提取 稱取沉香對照藥材粉末0.50 g，置于50 mL 具塞三角瓶中，加入甲醇10 mL，稱重，浸泡0.5 h，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）1 h，冷卻，再次稱重，滴加甲醇補足重量，搖勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待上機分析。

1.2.2 儀器參數 液相色譜儀器參數：WatersAtlantis T3 色譜柱（2.1 mm×50 mm， 3.0 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～5 min，5%～15% B；5～10 min，15%～20% B；10～28 min，20%～25% B；28～50 min，25%～35% B；50～60 min，35%～40% B；60～80 min，40%～90% B；80～87 min，90% B；87～88 min ， 90%～5% B； 88～90 min ，5% B ； 流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

飛行時間質譜儀儀器參數：ESI 離子源，電噴霧正離子模式，離子源電壓5500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣55 psi，輔助氣55 psi，氣簾氣35 psi，去簇電壓100 V，碰撞能量35 eV，能量擴展±15 eV，TOF-MS 掃描范圍50～1200 Da，Product Ion 掃描范圍50～1000 Da。掃描方式為IDA 模式。

1.3 數據處理

采取靶向檢索與非靶向檢索相結合策略。

靶向檢索：通過查詢文獻，建立PPECs 組分列表，包括英文名稱、CAS 號、分子結構式、分子量、二級碎片離子質荷比（m/z）等信息。將樣品數據導入PeakView 軟件進行檢索，依據測定的精確質量數與理論的精確質量數的偏差小于5 mmol/L 的原則以及同位素分布模式，確定各色譜峰的成分歸屬，根據二級碎片離子信息推斷各色譜峰所對應未知物的結構，并與文獻報道進行比對從而進一步確證結構。

非靶向檢索：樣品數據導入PeakView 軟件進行非靶向檢索，如果色譜峰的精確質量數與同位素偏差均小于5 mmol/L，母離子m/z 大于400，碎裂反應時以脫水、脫羰基等中性丟失為主要形式，且二級碎片離子中具有m/z 為91、107、121、137、164、192、227、239、255、267、283、301等特征離子，則初步判定該未知物屬于PPECs。采用Formula Finder 程序推測未知物分子式，并基于PPECs 的質譜裂解規律以及二級質譜碎片信息，推斷PPECs 中2-（2-苯乙基）色酮結構單元的類型和結合方式，以及取代基類型與位置，初步確定PPECs 的結構。繪制PPECs 結構式并將其導入PeakView 軟件，通過Frangment Pane 程序計算理論二級碎片與實際二級碎片之間的匹配度，從而確定PPECs 結構，并與文獻報道進行比對從而進一步確證結構。

2 結果與分析

2.1 PPECs 鑒定結果

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析沉香PPECs，在正離子模式下進行一級及二級質譜數據采集，獲得各未知物的保留時間、準分子離子峰及MS/MS 碎片離子的精確相對分子質量。共鑒定出PPECs 成分55 個，其中44 個DPECs、3 個TPECs 和8 個SPECs。DPECs 組分最為豐富，在總PPECs 中所占比例最高，達到80%；其次是SPECs（14.5%）；TPECs 組分最少，僅為5.5%。相關成分的質譜信息列于表1，結構見圖1～圖3。

2.2 質譜裂解規律分析

2.2.1 色酮二聚物（DPECs） 沉香樣品中共鑒定出44 個DPECs 成分，分別是化合物1～17、19～31、33、35、36、40～47 和48～50（表1，圖1）。圖1 表明，DPECs 的結構單元之間的連接方式具有差異性，根據2-（2-苯乙基）色酮單元之間連接方式的不同，44 個DPECs 成分分為4 種類型，A 型DPECs 的結構單元之間通過C-C 鍵相連，如化合物50；B 型DPECs 結構單元之間通過C-O-C 鍵相連，如化合物1、2、3、6、7 等；C 型DPECs 結構單元之間通過2 個C-O-C 鍵相連，如化合物3、4、5、36 等；D 型DPECs 其結構單元之間通過C-C 鍵和C-O-C 鍵相連，如化合物28、42、44～46。

DPECs 的質譜裂解具有較強的規律性，如常見的有脫水（[M+H-18]）、脫羧（[M+H-44]）、脫羰基（[M+H-28]+）、碳碳鍵（C-C）斷裂等[5， 11， 17]，這些規律是對DPECs 進行結構分析的重要依據。序號20、25、27 和41 的色譜峰其母離子具有相同的質荷比（m/z）和相同的分子式，鑒定為AH15及其同分異構體，它們的二級質譜圖與可能的質譜裂解途徑見圖4 和圖5。色譜峰20 母離子（[M+H]）m/z 為583.1986，連續2 次失去水分子分別產生碎片m/z 565.1865（[M+H-18]）和m/z 547.1758（[M+H-36]），m/z 547.1758 丟失羰基則產生碎片m/z 519.1807（[M+H-36-28]+），m/z519.1807 丟失苯環則產生碎片m/z 441.1330（[M+H-36-28-78]）。其次，m/z 583.1986 的C-O-C鍵發生斷裂，斷裂產物隨后發生脫水反應，生成碎片m/z 301.1078，m/z 301.1078 失去一分子水產生碎片m/z 283.0966，m/z 283.0966 脫去一分子羰基生成碎片m/z 255.1008，脫去一分子CO 則生成m/z 239.1049，m/z 283.0966 的色酮環與苯環之間C7′、C8′處的C-C 鍵受到電子轟擊而斷裂，生成碎片m/z 192.0398 和m/z 91.0525。根據以上分析，推測該未知物是AH15，即沉香四醇與6，7-二羥基-2-（2-苯乙基）色酮通過C-O-C 鍵相連形成的色酮二聚物。

同理，通過對其他色譜峰二級碎片等信息進行分析，確定了共44 種DPECs 化合物的結構（圖1）。其中9 個DPECs 化合物尚無文獻報道，即化合物1、7～11、13、14 和21，是潛在的新化合物。鑒定出分子式相同的一組同分異構體，但是無法確定結構中各取代基的空間朝向。

本研究從沉香樣品中鑒定的PPECs 組分普遍具有同分異構體，如AH13、AH15 各有4 個同分異構體，AH21、dehydroxy AH21、AH12 等各有2 個同分異構體。據LI 等[5]報道，沉香PPECs 同分異構體豐富，如，AH15 同分異構體多達13 個，AH21 同分異構體有7 個，hydroxyl AH11、AH12、AH13 則各有6 個同分異構體。PPECs 結構中含有色酮環，環上的氫原子、羥基、甲氧基等取代基的取代位置不同和化學鍵空間朝向不同是同分異構體豐富的主要來源。具有相同分子式的一組同分異構體的共同特征是質譜二級碎片大多相同，但保留時間不同。液相色譜-飛行時間質譜能鑒定出分子式相同的一組同分異構體，但是無法確定結構中各取代基的空間朝向。

2.2.2 色酮三聚物（TPECs） 從沉香樣品中共鑒定出3 個TPECs 組分，分別是化合物34、38、54（圖1），其中化合物34、38 為同分異構體。化合物54 的二級質譜圖與質譜裂解途徑見圖6 和圖7，母離子（[M+H]+）m/z 815.2865，失去一分子水生成碎片m/z 797.3320（[M+H-18]+），化合物54 結構中的C-O-C 鍵發生斷裂，生成2 個碎片m/z 267.1019 和m/z 567.2241，m/z 567.2241 脫去一分子水生成碎片m/z 549.1916，m/z 549.1916繼續脫水產生碎片m/z 531.1816，m/z 531.1816 中的酯鍵發生斷裂產生m/z 283.0969，m/z 283.0969脫去一分子CO 則生成m/z 239.1065。根據質譜裂解規律，推測化合物54 是由沉香四醇與兩分子5-羥基-2-（2-苯乙基）色酮通過C-O-C 鍵相連形成的色酮三聚物。化合物54 目前尚無文獻報道，推測為新化合物。

2.2.3 萜類-色酮二聚物（SPECs） 總共鑒定出8 個SPECs 組分，分別是化合物18、32、37、39、51、52、53 和55。4 個化合物（32、39、51 和52）被鑒定為aquilacrassnin A 及其同分異構體。化合物32 的二級質譜圖與質譜裂解途徑見圖8 和圖9。化合物32 母離子（[M+H]）m/z 535.2691，失去一分子水生成碎片m/z 517.2596（[M+H-18]），再失去一分子水生成碎片m/z 499.2468（[M+H-36]）。母離子結構中的酯健發生斷裂，生成2 個碎片m/z235.1678 和m/z 319.1194，m/z 319.1194 脫去一分子水生成碎片m/z 301.1054，m/z 301.1054 繼續脫水產生碎片m/z 283.0957，m/z 283.0957 中脫去苯甲基則生成m/z 192.0397。m/z 235.1678 脫去一分子水生成碎片m/z 217.1574，m/z 217.1574 脫去一分子羰基生成碎片m/z 189.1611。根據以上分析，推斷化合物32 為aquilacrassnin A，是沉香四醇與芹子-4，11-二烯-14-油酸（selina-4，11-dien-14-oicacid）通過酯鍵相連形成的二聚物。

3 討論

沉香2-（2-苯乙基）色酮類化合物種類豐富，但是同分異構體與立體異構體眾多，質譜規律呈現出多樣性與復雜性，質譜解析難度大。PPECs 的裂解規律與2-（2-苯乙基）色酮單元裂解規律相似，受到電子轟擊時往往先脫去一分子或多分子水，或脫羰基，然后色酮單元之間的化學鍵發生斷裂，生成2～3 個相應的色酮單元或脫水、脫羰基后的色酮單元，并在此基礎上進一步發生碎裂反應，例如色酮單元中連接色酮環和苯環的C7′、C8′處的C-C 鍵發生斷裂，形成色酮離子碎片和苯甲基離子碎片，以及色酮環上發生進一步脫水、脫羰基。

本研究采用超高效液相色譜-串聯四級桿-飛行時間質譜對沉香藥材中PPECs 進行分析，探討了PPECs 成分的質譜裂解規律。共鑒定出55 個PPECs 成分， 包括2-（2- 苯乙基） 色酮二聚物（DPECs）44 個，三聚物（TPECs）3 個，萜類-2-（2-苯乙基）色酮二聚物（SPECs）8 個，其中9 個DPECs、1 個TPECs 和1 個SPECs 首次在沉香中被發現。其次，沉香PPECs 的部分組分具有2～4個同分異構體。以上結果表明，沉香藥材中的PPECs 組分及其同分異構體豐富，且DPECs 類型的組分在總PPECs 中所占比例最高（80%）。研究結果為沉香藥效物質基礎研究及開發利用奠定基礎，為沉香藥材的現代化與標準化提供依據。