紅掌小滴玻璃化法超低溫保存研究

高潔　李志英　張玄兵　謝龍海　陳瑩　朱振芬　符運(yùn)柳　徐立

關(guān)鍵詞：紅掌；小滴玻璃化法；超低溫保存；腋芽；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.14 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

紅掌（Anthurium andraeanum Lind.）為天南星科（Araceae）多年生常綠草本植物，其花色多樣，佛焰苞獨(dú)特，插花效果大膽新穎，切花保存時(shí)間長(zhǎng)質(zhì)量?jī)?yōu)，是第二大熱帶花卉，也是世界銷(xiāo)量最大的“貴族”花卉之一。作為國(guó)際上重要的切花和盆栽觀賞植物，紅掌在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，在全球花卉貿(mào)易中，為世界五大設(shè)施花卉之一。在我國(guó)，2019 年紅掌的銷(xiāo)量為3500 萬(wàn)盆[1]。目前，紅掌在各個(gè)國(guó)家及地區(qū)都有商業(yè)栽培，品種日益增加，通過(guò)種間雜交已培育出大量栽培品種，2000 年已培育出紅掌優(yōu)良栽培品種600 余個(gè)[2-3]。獲得基因庫(kù)中可用的遺傳資源是紅掌育種遺傳改良成功的關(guān)鍵因素，但在新品種的推廣過(guò)程中，大多數(shù)傳統(tǒng)品種逐漸丟失。因此，種質(zhì)資源的保存對(duì)于紅掌生產(chǎn)及新品種的選育顯得極為重要。紅掌種質(zhì)資源保存方法以建立田間資源圃和試管苗保存種質(zhì)等傳統(tǒng)保存方法為主。種質(zhì)圃保存耗時(shí)費(fèi)力，占用大量土地資源，且在保存過(guò)程中易受病害侵?jǐn)_。而試管苗保存對(duì)溫度、光照和低濕等環(huán)境條件要求嚴(yán)格，導(dǎo)致保存能耗較高，需定期繼代，且易發(fā)生變異，影響種質(zhì)資源的保存效果。

目前，超低溫保存被認(rèn)為是長(zhǎng)期有效保存多種形式的植物種質(zhì)的首選方法，是不同于傳統(tǒng)的種質(zhì)資源田間與試管苗保存的一種替代方法，可在幾十年內(nèi)以較小的空間和較低的日常維護(hù)，在一個(gè)相對(duì)安全的條件下最大化地長(zhǎng)期保護(hù)植物的遺傳資源[4-5]。隨著對(duì)超低溫保存研究的不斷深入，發(fā)展出了許多冷凍方法，如兩步冷凍法、干燥冰凍法、玻璃化法、包埋-脫水法、包埋-玻璃化法、小滴玻璃化法等。小滴玻璃化法在吸取玻璃化法的主要優(yōu)點(diǎn)后，對(duì)冷凍及化凍程序進(jìn)行了改良，在冷凍過(guò)程中將植物材料直接與玻璃化液、裝載液及液氮接觸，因此能實(shí)現(xiàn)較快的冷卻或復(fù)溫速率，減少在冷卻和復(fù)溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，同時(shí)鋁箔是一種良好的熱傳導(dǎo)材料，熱量傳導(dǎo)快速且均勻[6]，提高了冷凍和化凍的速率，從而極大提高了超低溫保存植物種質(zhì)資源后的再生率[7]。小滴玻璃化法是目前應(yīng)用最廣泛的基因庫(kù)超低溫保存植物種質(zhì)的冷凍方法[8]，采用小滴玻璃化法已成功保存了菠蘿[9]、香蕉[7]、甘蔗[10]等熱帶草本植物。

盡管超低溫保存已是許多重要的經(jīng)濟(jì)植物的常規(guī)保存方法，但不同種類(lèi)植物、同種植物的不同資源對(duì)超低溫處理的反應(yīng)均不同，需要針對(duì)每份資源開(kāi)展研究。鑒于紅掌超低溫保存研究還較少，本研究通過(guò)小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)，在常規(guī)保存方法的基礎(chǔ)上對(duì)紅掌的小滴玻璃化超低溫保存條件進(jìn)行比較研究，篩選出適宜的保存條件，以期建立一種操作簡(jiǎn)便并能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存紅掌種質(zhì)資源的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以 中 國(guó) 熱 帶 作物中期庫(kù)提供的紅掌PinkChampion（PC）無(wú)菌苗約200 瓶為材料，組培苗在繼代培養(yǎng)基1/2MS+0.2 mg/L BA+0.2 mg/LNAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 卡拉膠（pH 5.8，高溫滅菌）上生長(zhǎng)2～3 個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 超低溫保存（1）預(yù)處理。切取1～2 mm 帶腋芽的莖段置于帶濾紙的預(yù)培養(yǎng)基（MS+0.4 mol/L蔗糖+2 mol/L Gly +6.5 g/L 卡拉膠，pH 5.8，高溫滅菌）上培養(yǎng)1～5 d。

（2）PVS2 脫水。預(yù)培養(yǎng)后，將材料轉(zhuǎn)入0 ℃的30%、60%、80%的PVS 溶液中，分別處理10、40、50、60、100 min，30%、60%、80%的PVS溶液分別由0.4 mol/L 蔗糖MS 溶液與3.26 mol/L甘油（7∶3， V/V）溶液、2.42 mol/L 乙二醇（4∶6，V/V）溶液和1.9 mol/L 二甲基亞砜（2∶8， V/V）溶液配置而成。

（3）液氮冷凍。在PVS2 處理結(jié)束前2 min 用無(wú)菌滴管將20 個(gè)材料轉(zhuǎn)到鋁箔條上，并加15 μL PVS液滴，整個(gè)過(guò)程保持在0 ℃環(huán)境下完成；用無(wú)菌鑷子將鋁箔條迅速浸入液氮（–196 ℃）中2 s 后快速轉(zhuǎn)入裝滿(mǎn)液氮的2 mL 凍存管中，關(guān)蓋后液氮中至少保持30 min；每個(gè)處理15 個(gè)材料轉(zhuǎn)移至液氮中，另外5 個(gè)直接轉(zhuǎn)移到RS（卸載處理溶液）中（對(duì)照），每個(gè)處理重復(fù)3 次。

（4）復(fù)溫卸載。復(fù)溫時(shí)將鋁箔迅速?gòu)囊旱腥〕?，放入室溫下的RS（卸載液：MS+1.2 mol/L蔗糖，pH 5.8，過(guò)濾滅菌）中浸泡幾秒后，液滴脫離，取出鋁箔片材料游離到卸載液中繼續(xù)保持15～20 min。

（5）用鑷子將上述復(fù)溫卸載后的材料置于無(wú)菌濾紙上，除去卸載液后，置于放置2 層無(wú)菌濾紙的半固體培養(yǎng)基（MS+0.3 mol/L 蔗糖）上，在25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

（6）再生2 d 后，將組織轉(zhuǎn)到無(wú)濾紙的再生培養(yǎng)基（ 1/2MS+0.8 mg/L BA+0.2 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 卡拉膠，pH 5.8，高溫滅菌）上，促進(jìn)材料分化愈傷組織，黑暗培養(yǎng)1 周后轉(zhuǎn)入光照條件，并轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，4 周后統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.2 DNA 提取和檢測(cè)根據(jù)改良的CTAB 法，提取紅掌小滴玻璃化法超低溫保存后的再生植株和未經(jīng)處理植株的DNA，通過(guò)SimpliNano 微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度及濃度，達(dá)到SSR 和ISSR要求后，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ISSR 分析利用 8 條UBC 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：12.5 μL Taq Master Mix，1.0 μL 模板，1.0 μL 引物，10.5 μL 無(wú)菌水。PCR程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，退火（溫度根據(jù)引物說(shuō)明設(shè)置）15 s，72 ℃延伸2 min（循環(huán)35 次），72 ℃延伸10 min。

1.2.4 SSR 分析利用 6 對(duì)已發(fā)表的紅掌SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。SSR 引物由廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系：12.5 μLTaq Master Mix，1.0 μL DNA，1.0 μL 正向引物，1.0 μL 反向引物，9.5 μL 無(wú)菌水。PCR 程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，退火（溫度根據(jù)引物說(shuō)明設(shè)置）15 s，72 ℃延伸1 min（循環(huán)33 次），72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存正交試驗(yàn)

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出（表2），在影響紅掌PC 腋芽超低溫保存存活率的因素中，PVS 濃度極顯著影響紅掌PC 腋芽超低溫保存的存活率，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間顯著影響紅掌PC腋芽超低溫保存的存活率，PVS 處理時(shí)間也影響其存活率。在9 個(gè)處理方案中，處理6（ABC：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間4 d、PVS 濃度80%和PVS處理時(shí)間40 min）的超低溫保存存活率最高，達(dá)61.48%。對(duì)比紅掌Amigo 胚性懸浮細(xì)胞超低溫保存32.1%的存活率[11]，有明顯提升。由表2 可知，紅掌PC腋芽超低溫保存過(guò)程中，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、PVS 濃度和PVS 處理時(shí)間3 個(gè)因素的最佳水平分別是4 d、80%和50 min（ABC），但此最佳水平組合并未在本試驗(yàn)中體現(xiàn)，對(duì)此結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)得出最佳處理組合后，還需開(kāi)展不同單因素對(duì)紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存存活率的影響。只變化單因素，其他處理按最佳水平即預(yù)處理4 d、PVS 濃度為80%和裝載50 min 進(jìn)行。如圖1A 所示，預(yù)培養(yǎng)與未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的存活率有明顯差異。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，紅掌PC 腋芽存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)。預(yù)培養(yǎng)4 d 的存活率最高，達(dá)60%，高于其他處理。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，紅掌細(xì)胞含水量逐漸減少，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)5 d 以后細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫，使部分細(xì)胞失去活性，降低存活率。

紅掌 PC 腋芽小滴玻璃化法超低溫保存后的存活率對(duì)PVS 裝載液濃度的變化比較敏感（圖1B）。隨著PVS 裝載液濃度的增加，紅掌PC 超低溫保存的存活率先逐漸增加后下降。當(dāng)PVS裝載液濃度為80%時(shí)，存活率最高，達(dá)61.48%。PVS 裝載液濃度對(duì)紅掌PC 超低溫保存的存活率）的影響比較明顯，而PVS 裝載液濃度過(guò)高后存活率反而下降。未經(jīng)PVS 裝載的紅掌材料沒(méi)有存活，可能是紅掌材料易受裝載液的毒害影響，但若不經(jīng)過(guò)裝載液保護(hù)紅掌材料則不能承受低溫凍害。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PVS裝載液處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紅掌PC 腋芽超低溫保存的存活率增加，但超過(guò)50 min 后，紅掌腋芽由于受PVS 的毒害，存活率反而下降。PVS 裝載液處理50 min 時(shí)，紅掌腋芽存活率最高，達(dá)63.70%（圖1C）。

綜上，正交試驗(yàn)所得的最佳處理組合能使紅掌PC 腋芽小滴玻璃化法超低溫保存的存活率達(dá)到最優(yōu)。

2.2 紅掌 PC 小滴玻璃化法超低溫保存的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

2.2.1 DNA 的提取提取紅掌PC 對(duì)照植株和再生植株的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果如圖 2 所示，為單一條帶，無(wú)降解現(xiàn)象，純度較高，滿(mǎn)足2 種標(biāo)記試驗(yàn)需求。

2.2.2 ISSR 電泳檢測(cè)結(jié)果 8 條ISSR 引物擴(kuò)增后，最多的能擴(kuò)增出11 條清晰的條帶（UBC 807），最少的能擴(kuò)增出3 條條帶（UBC840），8 條引物共擴(kuò)增出56 條條帶（表3）。圖3 所示為其中的6 條引物擴(kuò)增電泳圖，紅掌PC 對(duì)照和小滴玻璃化法超低溫保存再生植株條帶均一且無(wú)雜帶，初步證明紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存不會(huì)影響材料的遺傳穩(wěn)定性。

2.2.3 SSR 電泳檢測(cè)結(jié)果利用已發(fā)表的6 對(duì)SSR 引物進(jìn)行后續(xù)SSR 分析，結(jié)果表明，小滴玻璃化法超低溫保存后的紅掌樣品與保存前的樣品未出現(xiàn)差異性條帶（圖4），再次證明了紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存的再生植株未發(fā)生遺傳變異。因此，結(jié)合ISSR 電泳結(jié)果基本可以確定小滴玻璃化法超低溫保存不會(huì)改變紅掌PC 材料的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存后的增殖情況

紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存4～6 周后，材料會(huì)出現(xiàn)各種不同變化：材料長(zhǎng)出愈傷組織（圖5A），有些材料褐變死亡（圖5B）；無(wú)愈傷組織再生直接長(zhǎng)出腋芽（圖5C）；材料逐漸長(zhǎng)出腋芽和愈傷組織（圖5D）；超低溫保存5 個(gè)月后長(zhǎng)出的再生植株（圖5E）。

3 討論

植物遺傳資源是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的自然資源[12]，是物種進(jìn)化、植物育種和遺傳學(xué)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著植物遺傳多樣性和遺傳資源潛在價(jià)值的急劇減少，植物種質(zhì)資源保存成為一個(gè)全球共同關(guān)注的課題[13]。自HENSHAW 和MOREL 首次提出離體保存植物種質(zhì)資源后[14]，許多不能常規(guī)保存的植物得以保存。而在離體保存中超低溫保存是目前唯一能長(zhǎng)期保存物種的有效的理想手段[13]。植物種質(zhì)資源越來(lái)越多地使用超低溫保存技術(shù)，以確保無(wú)性繁殖植物資源的安全[15]。

在自然界中，許多植物在承受環(huán)境壓力下能夠形成保護(hù)機(jī)制，在冷凍保存程序之前加入預(yù)處理這一步驟，特別是一些對(duì)直接置于玻璃化液中十分敏感的熱帶植物，更有利于超低溫保存后植物材料的存活。預(yù)培養(yǎng)促使材料初步脫水減少細(xì)胞中的自由水含量，提高細(xì)胞脫水耐受性和滲透壓，減少超低溫保存過(guò)程中冰晶的產(chǎn)生和裝載過(guò)程中PVS 溶液的毒害。細(xì)胞溶液在超低溫保存過(guò)程中向玻璃化狀態(tài)的轉(zhuǎn)化是影響生物材料冷凍存活的重要因素[16]，置于液氮中的時(shí)間則不影響材料的存活率。在高山紅景天超低溫保存過(guò)程中，用1 mmol/L 蔗糖MS 預(yù)培養(yǎng)基效果最好[17]。從馬鈴薯小滴玻璃化法超低溫保存的研究中得出，預(yù)培養(yǎng)中用0.3、0.5 mmol/L 蔗糖的MS 液體培養(yǎng)基對(duì)馬鈴薯莖尖進(jìn)行梯度脫水1 d 后，莖尖的存活率和再生率最高[18]。羅漢果莖尖小滴玻璃化法超低溫保存使用含0.7 mmol/L 蔗糖的MS 培養(yǎng)基預(yù)處理1 d 效果更佳[19]。本研究結(jié)果表明，紅掌腋芽小滴玻璃化法超低溫保存需要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，使用含0.4 mmol/L 蔗糖和2 mmol/L 甘油的MS 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，紅掌PC 腋芽的存活率最高。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)后，腋芽的存活率反而下降，這可能與紅掌對(duì)高濃度蔗糖和甘油的耐性有關(guān)。

不同的低溫保存方法在技術(shù)細(xì)節(jié)上有所不同。然而，大多數(shù)都需要使用化學(xué)物質(zhì)保護(hù)——低溫保護(hù)劑。低溫保護(hù)劑相互作用，改變細(xì)胞內(nèi)外的水分布，使細(xì)胞脫水[20]。這些物質(zhì)增加了質(zhì)膜的穩(wěn)定性或完整性，降低了冰點(diǎn)，增加了細(xì)胞質(zhì)的黏度，同時(shí)在整個(gè)冷凍過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞不受傷害，是保證植物超低溫保存材料存活的關(guān)鍵。一般將不穿透細(xì)胞的低溫保護(hù)劑（蔗糖和其他碳水化合物）和穿透細(xì)胞的低溫保護(hù)劑（二甲基亞砜、乙二醇、甘油等）以不同比例組成PVS、PVS、PVS 等溶液[21]。PVS 中的二甲基亞砜是常用的滲透劑，但其毒性是完全發(fā)揮低溫保護(hù)潛力的根本障礙[22]。因此，在超低溫保存過(guò)程中，確定所使用的低溫保護(hù)劑的最佳濃度和暴露時(shí)間是至關(guān)重要的。本研究采用80% PVS 裝載液在0 ℃裝載50 min，效果最好。而月季莖尖的超低溫保存以60% PVS 裝載30 min 存活率最高[23]，羅漢果小滴玻璃化法的最佳處理是60%裝載液于25 ℃處理30 min[19]。

盡管近年來(lái)植物種質(zhì)資源超低溫保存研究取得了顯著進(jìn)展，但對(duì)于不耐低溫和脫水敏感的熱帶植物的超低溫保存研究還較少，目前報(bào)道的超低溫保存熱帶植物的種類(lèi)少，存活率極低[24-26]，還有大量熱帶作物的超低溫保存技術(shù)尚未開(kāi)展研究。以無(wú)性繁殖植物為主的熱帶植物，對(duì)超低溫保存技術(shù)的需求日益增加。國(guó)外關(guān)于紅掌的組織培養(yǎng)始于20 世紀(jì)70 年代末，國(guó)內(nèi)興起較晚，始于20 世紀(jì)90 年代，近幾年關(guān)于紅掌組織培養(yǎng)的報(bào)道越來(lái)越多[27]。本研究探索紅掌超低溫保存小滴玻璃化法的處理程序，結(jié)果表明，紅掌PC 腋芽放于含0.4 mmol/L 蔗糖和2 mmol/L 甘油的MS固體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d 后，在0 ℃下80% PVS溶液中裝載50 min，然后轉(zhuǎn)到鋁箔條上PVS 液滴中，將鋁箔條迅速浸入液氮中2 s 后直接轉(zhuǎn)入裝滿(mǎn)液氮的凍存管中，投入液氮至少保持30 min；室溫下用含有1.2 mmol/L 蔗糖的MS 液體培養(yǎng)基復(fù)溫，并卸載20 min 后置于恢復(fù)培養(yǎng)基上，腋芽存活率高且遺傳穩(wěn)定性好。本研究結(jié)果為建立紅掌小玻璃化超低溫保存體系奠定基礎(chǔ)，為紅掌種質(zhì)資源研究提供參考，對(duì)紅掌超低溫種質(zhì)資源基因庫(kù)的建立和其他熱帶草本植物的超低溫保存具有重要的理論和實(shí)踐意義。