circFAM73A靶向調控miR-140-3p對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的影響

李偉華,安書杰,孟 華,沙南希,王雙勇

(1.空軍軍醫大學西京醫院綜合診療科,陜西 西安 710032;2.廣州醫科大學附屬第三醫院眼科,廣東 廣州 510150)

糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者最常見的眼部并發癥之一,主要是由于高血糖導致視網膜血管異常和新生血管形成,從而引起視網膜水腫、出血、視網膜缺血等病變[1-2]。人視網膜血管內皮細胞在糖尿病視網膜病變中發揮了重要的作用[3]。人視網膜血管內皮細胞是視網膜血管的內層細胞,維持著視網膜血管壁的完整性和正常功能。在高血糖條件下,人視網膜血管內皮細胞受到損傷,導致血管內皮細胞功能障礙和血管通透性增加,從而加速了DR的發展[4-5]。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類環形RNA分子,具有穩定性和廣泛的表達特點[6]。最近的研究[7]表明,circRNA在DR的發生和發展中也發揮了重要作用。研究[8-9]發現circRNA參與了視網膜神經元凋亡、視網膜神經膠質細胞激活、視網膜毛細血管損傷等過程。研究[10]顯示circFAM73A在DR中顯著高表達,然而其具體作用和調控機制尚未完全明確。因此,本研究主要探討circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的影響,及對circFAM73A/miR-140-3p軸的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM/F12細胞培養基(美國Life Technologies Corporation公司),Trizol試劑(美國生命技術公司),RNA反轉錄試劑盒(日本Takara公司),Lipofectamine 3000和Protein A磁珠(美國Invitrogen公司),Transwell小室(Chemicon公司),HRP標記的羊抗兔IgG抗體(美國CST公司),RIP RNA試劑盒(美國Millipore公司),細胞凋亡試劑盒(中國上海弗元生物科技有限公司),Dual Luciferase Reporter Assay試劑盒(美國Promega公司),兔抗人TNF-α、IL-6和Cleaved caspase 3抗體(美國Sigma-Aldrich公司)。引物由中國上海生工合成,質粒由中國上海吉凱基因公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養與轉染:人視網膜血管內皮細胞購自美國ATCC細胞庫,采用含有10% FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養基,在5% CO2、37 ℃的條件下培養。當細胞密度達到70%～80%時,進行下一步實驗。細胞分為正常葡萄糖(NG)組和高葡萄糖(HG)組,葡萄糖干預濃度分為5.5 mmol/L和25 mmol/L。細胞轉染采用Lipofectamine 3000,將100 nmol/L的circFAM73A小干擾RNA(si-circFAM73A)、miR-140-3p inhibitors及相應陰性對照轉染至細胞中。轉染48 h后,進行后續實驗。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):采用Trizol試劑提取人視網膜血管內皮細胞RNA樣本,使用RNA反轉錄試劑盒對circRNA和mRNA進行逆轉錄,使用miRNA反轉錄試劑盒對miRNA進行逆轉錄。qPCR反應使用實時熒光定量PCR試劑盒(適用于circRNA和mRNA)和miRNA熒光定量PCR試劑盒(適用于miRNA)進行。以GAPDH(circRNA和mRNA)或U6(miRNA)作為內參并通過2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測:將野生型(WT)和突變型(MUT)3’-UTR circFAM73A的雙熒光素酶報告基因質粒與miR-140-3p mimic/nc mimic同時轉染入人視網膜血管內皮細胞中,并孵育48 h。隨后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性,并以Renilla熒光素酶活性作為內參測量熒光素酶活性。

2014年5月30日，由中國水利學會聯合禹城大禹文化研究會、國際生態安全合作組織、全聯環境服務業商會、水利部科技推廣中心共同主辦的“中國（國際）水務高峰論壇——2014中國·禹城水生態文明建設論壇”在山東禹城開幕。此次論壇主題為“水生態文明建設與縣域經濟”，來自全國相關政府部門、權威機構、學術單位的專家學者以及企業代表300余人齊聚一堂，共謀水生態文明建設之道。

1.2.4 遷移實驗:細胞被用預冷PBS洗滌兩次,然后在無血清的DMEM中稀釋到1×104/ml的細胞懸液。接下來,將Transwell小室插入24孔板中,基底腔包含含有10% FBS的培養基,而上面腔則包含細胞懸液。培養48 h后遷移的細胞被100%甲醇固定30 min,然后用0.1%結晶紫染色,倒置顯微鏡下觀察每個孔的五個隨機視野中遷移的細胞數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析。本研究的所有數據均以平均值±標準差表示,實驗至少重復進行了3次,使用Student’st檢驗或單因素方差分析(ANOVA)進行組間比較,使用Tukey的事后檢驗進行多重比較;P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:細胞轉染后采用PBS洗滌2次,在暗室中同時用膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色15 min。使用FC-500流式細胞儀識別FITC+和PI+/-的凋亡細胞,并計算各組細胞凋亡率。

circRNA能夠通過多種途徑調節人視網膜血管內皮細胞功能和DR的發展[11]。最常見的調控方式為circRNA作為miRNA的“海綿”吸附miRNA,從而影響miRNA的功能;另外部分circRNA則可以與RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)相互作用,調節人視網膜血管內皮細胞基因表達和蛋白翻譯;此外,還有部分circRNA與表觀遺傳修飾相關,可以影響人視網膜血管內皮細胞基因表達和功能[12-13]。而人視網膜血管內皮細胞在維持視網膜血管壁結構和功能上發揮著關鍵的作用[14]。高血糖狀態下,視網膜血管內皮細胞的功能異常,會導致視網膜微循環障礙,進而引發糖尿病視網膜病變[15]。因此,調控人視網膜血管內皮細胞生物學功能對控制DR進展具有重要作用。

1.2.5 Western blot:采用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的總蛋白質,然后用BCA蛋白質濃度檢測試劑盒測定蛋白質的濃度。將蛋白質通過10%的SDS-PAGE電泳分離,并將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。5% 脫脂牛奶封閉膜 2 h,使用含有 0.1% Tween-20 (TBST) 的 TBS 洗滌 ,然后在4 ℃下與一抗共同孵育過夜。第2天,將膜與二抗一起在25 ℃下孵育2 h。使用ECL試劑盒來分析蛋白質的表達水平。其中,GAPDH作內參計算各組蛋白相對表達量。

2 結 果

2.3 circFAM73A能夠靶向結合miR-140-3p 為驗證circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的具體作用機制。circFAM73A和miR-140-3p存在結合位點(圖3A),雙熒光素酶基因報告結果顯示circFAM73A-WT組中轉染miR-140-3p mimics后雙熒光素活性明顯下降(圖3B,P<0.05),RIP結果顯示circFAM73A和miR-140-3p能夠結合Ago2蛋白,在轉染miR-140-3p mimics能夠增加Ago2蛋白和circFAM73A的結合(圖3C,P<0.05)。miR-140-3p的表達水平在HG組顯著降低(圖3D,P<0.05),在HG組轉染si-circRNA FAM73A后,miR-140-3p的表達水平明顯高于HG+si-nc組(圖3D,P<0.05)。這提示circFAM73A能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p。

注:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001A:RT-qPCR檢測circFAM73A表達水平;B、C:流式細胞術檢測細胞凋亡情況;D、E:Western blot檢測凋亡相關分子Cleaved caspase 3表達水平圖1 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡的影響

布魯諾走下法庭前又轉過身來大聲說道：“我看見了，你們在宣判時比我更害怕！”這聲音嗡嗡地在教堂里回響。主教們趕忙擦著汗，夾起文件匆勿散去。

2.2 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子釋放的影響 HG組細胞遷移(圖2A,P<0.05)和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平(圖2B、C,P<0.05)明顯高于NG組,HG+si-circRNA FAM73A組細胞遷移(圖2A,P<0.05)和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平(圖2B、C,P<0.05)明顯低于HG+si-nc組。這提示沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。

注: ****P<0.0001A:Transwell檢測細胞遷移情況;B、C:RT-qPCR檢測炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平圖2 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子釋放的影響

2.1 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡的影響 對人視網膜血管內皮細胞分別采用5.5 mmol/L葡萄糖(NG組)或25 mmol/L葡萄糖(HG組)處理細胞,同時在HG組分別轉染si-nc(HG+si-nc組)和si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A組)。結果顯示circFAM73A的表達水平在HG組顯著升高(圖1A,P<0.05),在HG組轉染si-circRNA FAM73A后,circFAM73A的表達水平明顯低于HG+si-nc組(圖1A,P<0.05)。在人視網膜血管內皮細胞凋亡上,HG組細胞凋亡率明顯高于NG組(圖1B、C,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A組細胞凋亡率明顯低于HG+si-nc組(圖1B、C,P<0.05);HG組細胞凋亡相關分子Cleaved caspase 3的表達水平明顯高于NG組(圖1D、E,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A組細胞凋亡相關分子Cleaved caspase 3的表達水平明顯低于HG+si-nc組(圖1D、E,P<0.05)。這提示沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡。

Seepage calculation and discussion of double drainage blind ditch in finite thickness aquifer YE Kun WANG Xian-neng(68)

注:****P<0.0001A:circFAM73A和miR-140-3p結合位點;B、C:雙熒光素酶報告和RIP實驗證實circRNA FAM73A能夠靶向結合miR-140-3p;D:RT-qPCR檢測miR-140-3p表達水平圖3 circFAM73A能夠靶向結合miR-140-3p

2.4 circFAM73A/miR-140-3p軸對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的影響 為驗證circFAM73A/miR-140-3p軸對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的影響,在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中分別轉染si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A組)、miR-140-3p inhibitors(HG+miR-140-3p inhibitors組)和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors(HG+si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors組)。結果顯示低表達miR-140-3p能夠顯著促進高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡(圖4A、B,P<0.05)、凋亡相關蛋白Cleaved caspase 3的表達水平(圖4C、D,P<0.05)、遷移(圖4E、F,P<0.05)、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放(圖4G、H,P<0.05)。共轉染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能夠顯著減弱單獨轉染miR-140-3p inhibitors對人視網膜血管內皮細胞凋亡(圖4A、B,P<0.05)、凋亡相關蛋白Cleaved caspase 3的表達水平(圖4C、D,P<0.05)、遷移(圖4E、F,P<0.05)、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放(圖4G、H,P<0.05)。這提示circFAM73A能夠通過靶向結合miR-140-3p調控高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。

社會大眾借助社會化媒體，比如微信、微博等媒體平臺將信息快速傳播出去。在其他社會受眾對照片或視頻進行轉發評論的同時，社會信息的傳播實現了更加多樣化的傳播。在文字和照片以及信息的傳播過程中，信息得到及時交互，傳受關系得到進一步擴散[1]。但實際上，網上的關系并不是一種人際關系，這是一種新型的社會角色關系，當這種關系借助手機和社會化媒體發展，媒介融合的特質也得到進一步顯現，社會化媒體中的用戶關系和用戶地位也會隨時發生改變。

3 討 論

1.2.7 RNA免疫沉淀(RIP):收集培養的人視網膜血管內皮細胞,并用RIP裂解緩沖液重懸。接下來,將細胞提取物與含有抗Ago2抗體或小鼠免疫球蛋白G(IgG)對照結合的磁珠RIP緩沖液在4 ℃下孵育過夜。次日,洗滌磁珠3次,并將磁珠與蛋白酶K一起孵育。使用Trizol試劑從提取物中分離出總RNA。最后,通過RT-qPCR分析確定circFAM73A和miR-140-3p的相對富集量。

在糖尿病患者中,高血糖水平會導致視網膜血管內皮細胞凋亡的增加,這會引起視網膜缺血、缺氧和代謝紊亂,從而誘發新生血管生成和病變進展[16-17]。研究顯示circSLC16A12可以調控miR-140-3p/FGF2軸抑制視網膜血管內皮細胞凋亡,進而減緩DR的進展[18]。circVEGFC能夠通過miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA軸加重高糖誘導的血管內皮細胞凋亡[19]。本研究結果顯示circFAM73A的表達水平高糖處理的人視網膜血管內皮細胞中明顯高表達,高糖能夠明顯誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡,而沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡。

總之，列寧“政治遺囑”中關于領導干部政治品格、大局意識和專業素質等方面的要求，指向的是當時俄共（布）的干部隊伍，對今天我們黨加強干部隊伍建設仍然具有重要的啟發意義。面對新形勢、新任務，我們黨在要求領導干部學習馬列主義、毛澤東思想，提高政治理論素養的同時，也要高度重視領導干部的專業知識學習，使他們全面提高業務素質。正如習近平總書記所強調的，領導干部要“結合工作來學習，不斷提高自己的知識化、專業化水平。要堅持干什么學什么、缺什么學什么，有針對性地學習掌握好領導工作、履行崗位職責所必備的各種知識，努力使自己成為行家里手、內行領導”[2]405。

在糖尿病患者中,視網膜血管內皮細胞遷移增加,血管生成加速,血管通透性增加,細胞外基質合成和降解失衡,導致了視網膜微血管的結構和功能的改變[20-21]。同時,在DR中高血糖會誘導視網膜血管內皮細胞的炎性反應,促進白細胞黏附和滲出,導致視網膜水腫、出血和缺氧等病理改變[20]。研究顯示沉默circ-UBAP2能夠通過調控miR-589-5p/EGR1軸抑制視網膜微血管內皮細胞遷移和氧化應激,繼而抑制DR進展[22]。研究顯示抑制circ-0002570可以通過miR-1243/angiomotin軸抑制高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞的血管生成和炎性反應[10]。在本研究中,高糖能夠明顯誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放,而沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。這提示circFAM73A參與了高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。

為進一步探討circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的具體作用機制,雙熒光素酶報告和RIP實驗證實circRNA FAM73A能夠靶向結合miR-140-3p。miR-140-3p的表達水平在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中顯著降低,沉默circRNA FAM73A能夠促進miR-140-3p的表達,這提示circFAM73A能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p。研究顯示circ-0128846能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p調控骨關節炎的進展[23]。circRNA-0088036 能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p促進膀胱癌的進展[24]。

隨著一批批商業銀行的成功上市和市場競爭的加劇，銀行正在走向市場主導型的營銷模式，也加快了我國商業銀行營銷模式的轉變進程[4]。但是，在營銷戰略和觀念上，這種觀念的轉變還不夠徹底。外資銀行在進入中國市場后一般采取輕表內業務、重表外業務；輕傳統存貸業務、重現代創新業務；輕市場份額、重盈利增長和輕負債業務、重資產業務的重點化競爭戰略。相對外資銀行來說，我國城市商業銀行利潤的主要來源仍舊是傳統的存貸業務，因此，我國的城市商業銀行在一定程度上仍舊墨守過去的營銷策略和營銷理念。

研究顯示miR-140-3p在DR中顯著低表達,circRNA-0084043能夠通過靶向結合miR-140-3p促進高糖誘導的ARPE-19細胞凋亡、氧化應激和炎癥因子釋放[25]。本研究在恢復實驗中,在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中分別轉染si-circRNA FAM73A、miR-140-3p inhibitors和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors。結果顯示低表達miR-140-3p能夠顯著促進高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放;共轉染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能夠顯著減弱低表達miR-140-3p對人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的作用。因此,沉默circFAM73A能夠通過靶向結合miR-140-3p抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。