金絲桃苷抑制Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子-κB信號通路減輕牙周炎大鼠牙周組織損傷實驗研究

張 晶,賈翠楠,何 冰,李彬琦,鞏蘭平

(邯鄲市中心醫院口腔科,河北 邯鄲 056000)

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病,其主要特征為牙齦炎癥、牙槽骨吸收、牙周組織退化等,是常見的口腔疾病[1-2]。牙周炎隨著年齡增長其發病率持續升高,隨著我國人口老齡化的加劇,牙周炎嚴重威脅著人們的口腔健康[3]。如何利用藥物鞏固經典治療手段的治療效果是目前口腔醫生面對的主要問題。金絲桃苷是一種黃銅醇苷類化合物,在金絲桃科、桔?？啤⑺N薇科等多種植物中廣泛存在,其具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化和心肌保護作用,在多種疾病中發揮重要作用[4]。已有研究[5]報道,金絲桃苷具有促進大鼠成骨分化、骨髓間充質干細胞增殖的作用,對牙周炎具有潛在治療特性。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路與炎性反應密切相關。據報道,金絲桃苷可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來減輕復發性流產大鼠炎性反應[6]。但金絲桃苷是否可通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路治療牙周炎尚未可知。因此,本研究基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探究金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級SD雄性大鼠,10周齡,體重341～369 g,購自上海博湖生物技術有限公司,動物生產許可證號SCXK(滬)2020-0014,大鼠在室溫22～27 ℃,濕度52%～62%,晝/夜各12 h循環照明的環境中飼養,自由飲水、攝食。本研究經本院倫理委員會批準。金絲桃苷(批號NJ528-44,原料藥,純度≥99.83%,與0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為3 mg/ml的混懸液)購自嘉興南箭生物材料有限公司;脂多糖(批號HX28504,與0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為0.04 mg/ml的混懸液)、標準菌混合懸液(批號HX25119)、HE染色試劑盒(批號HX25115)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(批號HX41159)、蛋白裂解液(批號HX44106)、ECL試劑(批號HX59259)均購自蘇州泓迅生物科技有限公司;大鼠骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)(批號DH20400)、NF-κB受體活化因子配體(RANKL)(批號DH42815)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號DH58185)、白介素-6(IL-6)(批號DH69004)ELISA試劑盒均購自廣州達暉生物技術有限公司;Trizol試劑(批號ZJ41955)、逆轉錄試劑盒(批號ZJ58295)、PCR試劑盒(批號ZJ68194)、BCA試劑盒(批號ZJ40220)均購自福州載基生物科技有限公司;兔源TLR4(批號RN42611)、MyD88(批號RN69192)、NF-κB(批號RN53150)、GAPDH(批號RN44359)一抗、羊抗兔二抗(批號RN67392)均購自杭州然鈉生物科技有限公司。顯微鏡(型號BM1650A)、酶標儀(型號Infinite 200 Pro)、熒光定量PCR儀(型號Quant Studio 3)、凝膠成像系統(型號Quick Gel 6200)均購自江蘇楚天生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型的構建及分組給藥:構建牙周炎大鼠模型[7],麻醉大鼠,選用0.2 mm的正畸鋼絲在第1、2磨牙間隙中穿過,結扎雙側上頜1、2磨牙牙頸部,將結扎線深埋入大鼠牙齦溝,同時于牙齦溝接種濃度為109CFU/ml的4種標準菌混合液。結扎1周后檢查鋼絲是否牢固,8周后若大鼠牙周可見牙齦紅腫、探診易出血,有深牙周袋形成則表明牙周炎大鼠造模成功。將45只建模成功的大鼠隨機分為模型組、金絲桃苷(30 mg/kg)組[8]、金絲桃苷(30 mg/kg)+TLR4激活劑(脂多糖,0.4 mg/kg)組[9],每組15只,另取15只健康大鼠作為對照組。建模結束后,金絲桃苷組大鼠腹腔注射30 mg/kg的金絲桃苷[8];金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠于腹腔分別注射30 mg/kg金絲桃苷和0.4 mg/kg脂多糖[9];對照組、模型組大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液,各組給藥每天1次,連續4周。

1.2.2 標本采集:末次給藥結束24 h后,麻醉大鼠,腹主動脈取血,4 ℃下4400 r/min離心16 min,取上清,置于-80 ℃冰箱中保存,隨即斷頭處死大鼠,分離牙周組織,取部分牙周組織置于-80 ℃冰箱中保存,剩余牙周組織固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠牙周組織病理學變化:取固定于4%多聚甲醛中的大鼠牙周組織,石蠟包埋,切片(4 μm),取部分切片,HE染色,每張切片隨機觀察6個視野,光鏡下觀察。

1.2.4 TRAP染色檢測大鼠牙周組織破骨細胞數量:取其余切片,TRAP固定液固定60 s,使用TRAP染色試劑盒染色,脫水封片后,每張切片隨機觀察6個視野,在光鏡下計數破骨細胞數量(破骨細胞細胞質被染為紅色,細胞核被染為藍色),取平均值。

1.2.5 ELISA法檢測各組大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達水平:取凍存大鼠血清,低溫融化,按照OPG、RANKL、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說明書,檢測大鼠血清中OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達水平。

1.2.6 熒光定量PCR法檢測各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平:取凍存大鼠牙周組織,加入液氮研磨,Trizol試劑提取大鼠牙周組織總RNA,逆轉錄為cDNA,熒光定量PCR法檢測大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平,以GAPDH為內參。反應體系為:cDNA 2 μl、緩沖液5 μl、dNTPs 4 μl、正反向引物各1 μl、DNA聚合酶1 μl、ddH2O 16 μl。反應程序為:95 ℃預變性10 min,然后進行40個循環(95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 60 s),72 ℃延伸10 min。引物由鄭州樂睿生物技術有限公司設計、合成,引物序列見表1。被測mRNA相對表達量計算方法采用基因定量方法(2-ΔΔCt法)。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印跡法檢測各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平:取大鼠凍存牙周組織,研磨,加入蛋白裂解液提裂解,BCA法定量總蛋白,電泳、轉膜、封閉,然后將膜與稀釋好的兔源TLR4(1∶1500)、MyD88(1∶1200)、NF-κB(1∶1100)、GAPDH(1∶1900)一抗在4 ℃下孵育過夜,然后將膜暴露于稀釋好的羊抗兔二抗(1∶2100)中,室溫孵育2 h,加入ECL試劑檢測蛋白質印跡,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參,計算TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織病理學變化的影響 對照組大鼠牙周組織結構正常;模型組大鼠牙周組織炎性細胞浸潤明顯,伴隨骨吸收陷窩數量增多;與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙齦上皮較完整,炎性細胞浸潤程度較輕,骨吸收陷窩減少;與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織炎性細胞浸潤程度加深,骨吸收陷窩增多。見圖1。

2.2 金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織破骨細胞數量的影響 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織破骨細胞數量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織破骨細胞數量顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織破骨細胞數量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠牙周組織破骨細胞數量比較(個)

2.3 金絲桃苷對牙周炎大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達水平的影響 與對照組相比,模型組大鼠血清OPG水平顯著降低(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠血清OPG水平顯著升高(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著降低(均P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠血清OPG水平顯著降低(均P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達水平比較

2.4 金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平的影響 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較

2.5 金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平的影響 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平比較

3 討 論

牙周炎能致使人牙齒缺失,是一種破壞性疾病,其不僅對人們的口腔健康有嚴重危害,也與全身系統疾病的發生緊密相關,例如心臟病、糖尿病、骨質疏松癥等[10-11]。盡管近年來對牙周炎的研究進展較快,但其發病率仍然呈現上升的趨勢[12],因此,深入探究牙周炎的發病機制,尋找治療牙周炎有效的方法、藥物具有重要意義。本研究通過結扎大鼠雙側上頜1、2磨牙牙頸部建立牙周炎大鼠模型,結果發現,與健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙槽骨吸收,可見大量炎性細胞浸潤,出現大量骨吸收陷窩,TNF-α、IL-6水平升高,與陳晨等[7]研究結果類似,說明牙周炎大鼠建模成功。牙槽骨吸收是牙周炎的一種臨床表現,當牙槽骨骨形成速度低于骨吸收速度,牙周炎患者的牙齒將會松動,這也是導致牙齒缺失的主要原因之一[13-14]。OPG能抑制破骨細胞形成及骨吸收,這與RANKL的作用相反,OPG水平升高、RANKL水平降低即表明牙槽骨吸收被阻斷,牙周組織損傷得到抑制[15]。本研究發現,同健康大鼠比,牙周炎大鼠牙周組織破骨細胞數量、血清RANKL水平升高,血清OPG水平降低,提示牙周炎大鼠牙周組織牙槽骨吸收加速,牙周組織發生損傷。

金絲桃苷是一種廣泛存在于各種植物內的天然黃酮類化合物,已有文獻報道,金絲桃苷對脂多糖誘導的人臍靜脈內皮細胞炎癥和細胞凋亡具有抑制作用[16],其也能夠提高IL-1β誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞活性,抑制炎性因子和細胞外基質紊亂[17]。本研究發現,使用金絲桃苷處理牙周炎大鼠后,大鼠牙周組織病變減輕,牙周組織破骨細胞數量、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著降低,血清OPG水平顯著升高,與Xu等[5]研究結果一致,說明金絲桃苷可能通過減少破骨細胞的形成和牙槽骨吸收,抑制炎性反應,來改善牙周炎大鼠的牙周組織損傷。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在多種細胞中廣泛存在,是炎性反應關鍵通路,抑制該通路可阻斷多種疾病的發生發展進程[18-19]。相關研究表明,阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活化可減輕牙周膜細胞炎癥[20];本研究發現,與健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平明顯升高,提示TLR4/MyD88/NF-κB通路可能參與了牙周炎大鼠牙周組織損傷,該通路可能處于激活狀態,其促進了牙周組織的骨吸收、抑制骨形成。與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平顯著降低,推測金絲桃苷可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕牙周炎大鼠的牙周組織損傷。為了驗證該推測,本研究利用TLR4激活劑脂多糖進行干預,結果發現,與金絲桃苷組比較,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織損傷以及骨吸收加重,牙周組織破骨細胞數量、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達水平、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高,OPG水平顯著降低,說明TLR4激活劑可部分逆轉金絲桃苷對牙周炎大鼠的改善效果,進一步表明金絲桃苷可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,調控炎癥以及骨吸收相關因子表達,促進牙槽骨修復,改善牙周炎大鼠牙周組織損傷。

綜上所述,金絲桃苷可緩解牙周炎大鼠牙周組織損傷,抑制大鼠炎性反應和牙槽骨吸收,其機制與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。但本研究未對牙周炎大鼠的氧化應激相關指標進行檢測與分析,且未對通路的上下游調控因子進行更深入的探究,不能確定金絲桃苷對牙周炎大鼠牙周組織損傷的改善作用是否與氧化應激以及通路上下游調控有關,對此,后續將針對不足之處進行相關實驗設計,以完善金絲桃苷對牙周組織損傷的機制研究。