羥氯喹通過Toll樣受體4/核因子-κB信號通路對系統性紅斑狼瘡小鼠肺損傷的影響

付永濤,王莉平,郭金明,張 娜,張紅霞,許 冰

(1.邯鄲市中心醫院,河北 邯鄲 056001;2.石家莊市第四醫院,河北 石家莊 050035;3.邯鄲市邯鋼醫院,河北 邯鄲 056001)

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)臨床表現以紅斑皮疹為主并易累及肺、腎、心等器官組織,多發于育齡期女性。據統計,50%～70%的SLE患者伴隨不同程度的肺損傷,可引發肺感染、間質性肺疾病、肺栓塞、肺動脈高壓、肺萎縮綜合征等肺部并發癥,是導致SLE患者死亡的主要因素[1]。SLE發病機制非常復雜,其中炎性反應在SLE發生發展過程中發揮著重要作用,研究證實,肺部炎癥是SLE肺損傷進行性加重的重要病理通路[2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路在炎性反應調控機制中扮演著重要角色[3]。有文獻報道通過抑制TLR4/NF-κB信號通路能夠減輕SLE小鼠炎性反應[4]。羥氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)是一種4-氨基喹啉衍生物,具有調節免疫、抗炎等藥理學作用,目前主要用于類風濕關節炎以及毒性較小藥物療效不佳的自身免疫性疾病的治療。近年來研究發現HCQ對SLE所致動脈粥樣硬化、腎損傷等并發癥具有明顯的保護作用,其作用機制與抑制炎性反應有關[5-6]。此外,HCQ可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕創傷性腦損傷小鼠神經炎癥[7]。但HCQ是否對SLE肺損傷具有保護作用尚未見文獻報道。本研究旨在探討HCQ對SLE模型小鼠肺損傷的影響,并基于TLR4/NF-κB信號通路探索其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠(自發型SLE小鼠模型)和8只雌性C57BL/6小鼠購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010],7～8周齡,19～22 g。在室溫23～25 ℃、濕度45%～65%、12 h光暗交替的清潔環境下飼養。

1.2 試劑與儀器 HCQ片(上海上藥中西制藥公司,國藥準字H19990263,批號2022A04016);TAK242(TLR4抑制劑,美國CST公司);LPS(TLR4激動劑,美國Sigma公司);抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA(ds-DNA)ELISA法檢測試劑盒(北京華英生物技術研究所);干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6 ELISA法檢測試劑盒和RIPA裂解液、ECL顯色液(北京索萊寶生物科技公司);HE、Masson染色試劑盒和總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京博奧森生物技術公司);RT-qPCR逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒(日本Takara公司);IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司);TLR4、NF-κB p65、IκBα、β-actin抗體(英國Abcam公司)。PUR2型肺功能儀(法國EMKA公司);MK-3型酶標儀(芬蘭雷勃集團);RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司);220R型高速冷凍離心機(德國Hettich公司);ETC811型PCR儀(北京東勝創新公司);552BR型電泳儀、Turbo System型電轉儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與給藥:8只雌性C57BL/6小鼠設為正常對照組。32只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠按照隨機數字表法隨機分為模型組、HCQ組、HCQ+TAK242組和HCQ+LPS組,每組8只。HCQ組灌胃(IG)給予80 mg/kg HCQ(根據人與小鼠劑量換算公式計算所得),HCQ+TAK242組IG給予80 mg/kg HCQ和腹腔注射(IP)給予0.3 mg/kg TAK242[8];HCQ+LPS組IG給予80 mg/kg HCQ和IP給予2.5 mg/kg LPS[8];正常對照組和模型組IG給予0.9%氯化鈉溶液,各組均1次/d給藥連續治療5周。

1.3.2 肺功能指標檢測:末次給藥2 h后,IP 0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉小鼠,連接肺功能檢測儀,待小鼠呼吸平穩以后,測定肺功能指標,包括氣道阻力(Raw)、動態肺順應性(Cdyn)和第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1)。

1.3.3 ELISA法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平:應用注射器將1 ml磷酸鹽緩沖液緩慢注入小鼠肺組織,30 s后回抽并收集液體,重復灌洗3次,遵照ELISA法試劑盒操作說明檢測肺泡灌洗液中炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平。

1.3.4 ELISA法檢測血清免疫學指標水平:摘眼球取血并分離血清,遵照ELISA法試劑盒操作說明檢測血清免疫學指標ANA、ds-DNA表達水平。

1.3.5 HE、Masson染色法觀察肺組織病理學改變和纖維化狀況:頸椎脫臼處死小鼠后,開胸取肺臟,0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后,左肺組織置于-20 ℃保存備檢,將右肺組織置于10%中性甲醛溶液中固定72 h,然后依次行梯度乙醇溶液脫水、浸石蠟包埋、5 μm切片、展片和烤片處理,經梯度乙醇溶液脫蠟水化后分別行HE染色和Masson染色。①通過觀察HE染色切片考察肺組織病理學改變,參照劉云濤等[9]報道的方法進行肺組織病理評分:肺組織未見病理學形態結構改變,記0分;肺組織肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚、毛細血管擴張等病變的面積占視野面積的比例<25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別記1、2、3、4分。②通過觀察Masson染色切片考察肺組織纖維化狀況,藍色為膠原纖維著色。膠原容積分數(CVF)=(藍色著色面積/總面積)×100%。

1.3.6 RT-qPCR法檢測肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達:取部分左肺組織,Trizol法提取總RNA,按試劑盒操作說明依次進行RNA逆轉錄和PCR擴增(95 ℃預變性5 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s進行45個循環)。β-actin作為內參,以2-ΔΔCt公式計算TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA相對表達量。PCR引物由生工生物工程(上海)公司設計與合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot法檢測肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達:在冰上,取適量左肺組織通過RIPA裂解后提取總蛋白,經蛋白濃度測定和高溫變性處理后,30 μg總蛋白量上樣,依次進行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜、封閉處理,4 ℃孵育一抗稀釋液TLR4(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、內參β-actin(1∶2000)過夜,TBST溶液洗膜3×5 min后室溫孵育二抗稀釋液(1∶2000)1.5 h,TBST溶液洗膜3×5 min后加ECL顯影,與內參條帶灰度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 HCQ對SLE小鼠肺功能的影響 見表2。與正常對照組相比,模型組小鼠肺功能指標Raw明顯升高,Cdyn和FEV0.1明顯降低(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組Raw明顯降低,Cdyn和FEV0.1明顯升高(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組Raw明顯降低,Cdyn和FEV0.1明顯升高(均P<0.05),HCQ+LPS組Raw明顯升高、Cdyn和FEV0.1明顯降低(均P<0.05)。

表2 HCQ對SLE小鼠肺功能的影響

2.2 HCQ對SLE小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平的影響 見表3。與正常對照組相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05),HCQ+LPS組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(均P<0.05)。

表3 HCQ對SLE小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達水平的影響(pg/ml)

2.3 HCQ對SLE小鼠血清中免疫學指標的影響 見表4。與正常對照組相比,模型組小鼠血清中ANA、ds-DNA水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組ANA、ds-DNA水平明顯降低(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組ANA、ds-DNA水平明顯降低(均P<0.05),HCQ+LPS組ANA、ds-DNA水平明顯升高(均P<0.05)。

表4 HCQ對SLE小鼠血清中免疫學指標的影響(pg/ml)

2.4 HCQ對SLE小鼠肺組織病理學改變的影響 見圖1、2。正常對照組肺組織形態結構未見異常。模型組小鼠肺組織呈現肺泡壁增厚、肺泡腔縮小、泡腔可見滲出物、肺泡間隔和肺間質增厚、彌漫性炎性細胞浸潤等病理學改變。與模型組比較,HCQ組肺組織病理學改變均明顯改善。與HCQ組比較,HCQ+TAK242組肺組織病理學改變明顯改善,HCQ+LPS組病理學改變明顯加重。與正常對照組相比,模型組肺組織病理評分明顯升高(P<0.05);與模型組相比,HCQ組肺組織病理評分明顯降低(P<0.05);與HCQ組比較,HCQ+TAK242組肺組織病理評分明顯降低(P<0.05),HCQ+LPS組肺組織病理評分明顯升高(P<0.05)。

圖1 HCQ對SLE小鼠肺組織病理學改變的影響(HE染色,×200)

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖2 HCQ對SLE小鼠肺組織病理評分的影響(n=8)

2.5 HCQ對SLE小鼠肺組織纖維化的影響 見圖3、4。正常對照組肺組織僅肺泡間隔區域呈現少量膠原纖維。與正常對照組相比,模型組肺泡間隔和肺間質區膠原纖維明顯增多。與模型組比較,HCQ組肺泡間隔和肺間質區膠原纖維明顯減少。與模型組相比,HCQ組肺泡間隔和肺間質區膠原纖維明顯減少。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組肺泡間隔和肺間質區膠原纖維明顯減少,HCQ+LPS組肺泡間隔和肺間質區膠原纖維明顯增多。模型組小鼠肺組織CVF較正常對照組明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,HCQ組CVF明顯降低(P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組CVF明顯降低(P<0.05),HCQ+LPS組CVF明顯升高(P<0.05)。

圖3 HCQ對SLE小鼠肺組織纖維化的影響(Masson染色,×200)

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖4 HCQ對SLE小鼠肺組織CVF的影響(n=8)

2.6 HCQ對SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達的影響 見圖5。與正常對照組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達明顯上調(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達明顯下調(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達明顯下調(均P<0.05),HCQ+LPS組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達明顯上調(均P<0.05)。

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖5 HCQ對SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達的影響(n=8)

2.7 HCQ對SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達的影響 見圖6。與正常對照組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達明顯上調(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達明顯下調(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達明顯下調(均P<0.05),HCQ+LPS組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達明顯上調(均P<0.05)。

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖6 HCQ對SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達的影響

3 討 論

目前,SLE動物模型主要有自發型和人工誘導型兩大類。自發型SLE動物模型(如:MRL/lps小鼠、BXSB小鼠和NZB×NZW F1小鼠)具有遺傳穩定性好、發病機制及病情進展與人類相似等優點,是目前探索SLE病理機制及新藥研究最常用的動物模型,其中雌性MRL/lps小鼠模型最為經典[10]。本研究選擇雌性MRL/lps小鼠作為受試SLE動物模型,結果顯示,經HCQ治療5周能夠明顯改善SLE小鼠肺功能(降低Raw并提高Cdyn、FEV0.1),減輕肺組織病理學改變和纖維化狀況,降低病理評分和CVF,該結果與謝長好等[11]和談欣怡等[12]研究結果相似。表明HCQ對SLE小鼠肺損傷具有保護作用,對SLE小鼠肺功能具有改善作用。

SLE病理機制復雜,與環境、遺傳、免疫、激素等多因素相關,有文獻[13]報道T細胞和B淋巴細胞異常活化導致免疫功能紊亂及免疫復合物沉淀,進而引發IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子大量分泌是SLE及其并發癥進行性加重的重要機制。免疫學指標血清ANA、ds-DNA水平與SLE活動度密切相關,是公認的SLE臨床診斷指標[14]。IFN-γ在SLE發病機制中發揮著中樞介質的作用,抑制IFN-γ可作為自身免疫性疾病治療靶點[15]。炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6能夠刺激巨噬細胞等進一步釋放炎癥因子并促進炎性細胞浸潤,從而加重炎癥損傷[16]。本研究結果顯示,經HCQ治療能夠明顯降低SLE小鼠血清ANA、ds-DNA水平和肺泡灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,提示HCQ可改善SLE小鼠免疫功能并降低肺組織炎性反應,這可能是HCQ減輕SLE小鼠肺損傷并改善其肺功能的重要機制。

Toll樣受體(TLRs)是一類跨膜識別受體,Jiang等[17]報道TLRs 中的TLR4亞型介導單核細胞活化后釋放大量TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放,在SLE發生發展過程中發揮著重要作用。TLR4下游靶蛋白NF-κB是一種由p65和p50兩種亞基組成的異源二聚體,生理狀態下NF-κB定位于細胞質以無活性的“NF-κB-IκBα”聚合體形式存在,TLR4可誘導“NF-κB-IκBα”聚合體解離和游離態NF-κB核轉位,入核后NF-κB p65亞基可促進IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子轉錄與表達,進而誘導炎性反應[18-19]。本研究發現,經HCQ治療能夠明顯降低SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA和蛋白表達量,提示HCQ降低SLE小鼠肺組織炎性反應可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。該結果與Tumurkhuu等[20]研究結果相似。為了驗證上述推論,本實驗設置了HCQ+TAK242(TLR4抑制劑)組和HCQ+LPS(TLR4激動劑)組,結果顯示,TAK242可明顯增強HCQ對SLE小鼠肺組織病變、肺功能、免疫功能、炎性反應指標以及TLR4/NF-κB信號通路的調控作用,而LPS則能夠明顯逆轉HCQ對SLE小鼠各指標的調控作用,從而進一步證實了HCQ減輕SLE小鼠肺損傷的作用與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

綜上所述,HCQ可減輕SLE小鼠肺損傷,改善其肺功能,其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路,減輕炎性反應有關。本研究結果為HCQ作為SLE肺損傷治療藥物提供了理論依據,但其作用機制尚需進一步研究。